Pour commencer la quantification des métriques de gouttelettes lipidiques IMAT colorées, ouvrez les piles confocaux dans ImageJ. Ouvrez l’interface utilisateur de Threshold en sélectionnant Image, puis Ajuster, puis Seuil. Dans l’interface utilisateur, sélectionnez Intermodes comme type de seuillage et assurez-vous que l’option Arrière-plan sombre est sélectionnée.
Cliquez ensuite sur Appliquer pour exécuter un algorithme de seuillage. Exécutez l’algorithme de bassin versant pour séparer les gouttelettes lipidiques qui se touchent en sélectionnant Processus, puis Binaire et Bassin versant. Sélectionnez Oui dans une boîte de dialogue pour traiter toutes les images de la pile afin d’ajouter une fine ligne noire séparant de plus grandes zones de blanc uni.
Pour définir les tailles de particules maximales et minimales, ouvrez l’image d’origine et tracez le contour de la plus petite et de la plus grande gouttelette lipidique visible à l’aide de l’outil Ovale. Ajoutez ensuite ces formes au gestionnaire de retour sur investissement en tapant T.Sélectionnez Analyser, puis Définir les mesures. Dans la boîte de dialogue, sélectionnez les paramètres, cochez Zone uniquement, puis cliquez sur OK. Sélectionnez ensuite Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement.
Utilisez les deux mesures de surface de cette fenêtre de résultats comme plage de taille et analysez les particules. Identifier la région d’intérêt, ou ROI, à l’aide de l’algorithme d’analyse des particules. Sélectionnez Analyser, puis Analyser les particules.
Une boîte de dialogue s’ouvre pour définir les paramètres de sélection. Pour générer les mesures de retour sur investissement, sélectionnez Analyser, puis Définir les mesures, puis Surface, Centroïde, Ajuster l’ellipse et Position de la pile. Cliquez sur OK. Sélectionnez ensuite Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement.
Les données du tableau de résultats peuvent être sélectionnées et copiées dans Excel pour une analyse plus approfondie. Pour une évaluation détaillée des paramètres et de la distribution des gouttelettes lipidiques individuelles, les gouttelettes lipidiques marquées par fluorescence BODIPY ont été imagées par microscopie confocale. Le seuillage et la segmentation de la forme ont fourni un bon premier passage pour générer des retours sur investissement pour chaque gouttelette lipidique.
Cependant, des modifications manuelles ont été nécessaires pour corriger les erreurs. Les gouttelettes lipidiques profondes, qui semblaient sombres sur l’image, peuvent être ajoutées à la main à l’aide de l’outil Ovale d’ImageJ. Un groupe de gouttelettes lipidiques identifiées à tort comme un seul retour sur investissement peut également être corrigé en supprimant et en remplaçant le retour sur investissement d’origine par plusieurs nouveaux retours sur investissement.
Lorsqu’une seule gouttelette lipidique a été identifiée comme un retour sur investissement unique en plusieurs tranches, les retours sur investissement dupliqués ont été consolidés en un seul retour sur investissement.
