Pour infecter les cotylédons de soja avec Agrobacterium rhizogenes, concevoir des amorces pour détecter le gène du plasmide TI virD2 en utilisant la séquence du plasmide Agrobacterium rhizogenes PRI2659. Après transformation, tester les colonies d’Agrobacterium pour la rétention de virD2 par PCR à l’aide d’un kit PCR. Après avoir sélectionné les colonies d’Agrobacterium rhizogenes contenant à la fois virD2 et le gène d’intérêt, étaler quelques colonies sur les plaques LB contenant 100 milligrammes par litre de spectinomycine pour le plasmide d’intérêt.
Le lendemain, à l’aide d’un embout de pipette P200, grattez une longueur de 1,5 centimètre de l’Agrobacterium de la plaque LB et remettez-la en suspension dans un millilitre de tampon phosphate. Diluer la suspension cellulaire remise en suspension et l’eau ultrapure stérilisée dans de l’acétosyringone. Mesurez l’absorbance à l’aide d’un tube cuvette à une densité optique de 600 nanomètres.
Ensuite, dans une armoire de biosécurité, trempez un scalpel stérilisé dans la solution d’Agrobacterium et faites une coupe d’un millimètre de profondeur le long de la surface interne du cotylédon. Placer six à huit cotylédons coupés côté vers le bas sur une boîte de Petri contenant du papier filtre saturé de germination et un milieu de culture avec de l’acétosyringone. Incuber les plaques à température ambiante pendant trois jours sous une période photo de 16 heures.
Après trois jours, transférer les cotylédons infectés sur une racine velue, ou plaques HRG. Incuber les plaques dans les chambres de croissance réglées à 22 degrés Celsius et une intensité lumineuse de 100 micromoles sur une période de photo de 16 heures jusqu’à ce que des racines primaires avec des racines secondaires de deux à trois centimètres de longueur soient observées. Après trois à quatre semaines, récoltez les racines primaires qui poussent à partir du cal et contiennent des racines secondaires à l’aide d’un scalpel stérile et d’une pince.
Transférer les racines dans des plaques HRG de sélection contenant les antibiotiques appropriés et les laisser pousser pendant cinq jours supplémentaires. Le cinquième jour, récoltez des racines velues transgéniques avec des racines secondaires de trois à six centimètres de long. Si vous observez des protéines fluorescentes, assurez-vous que les racines secondaires ont peu d’autofluorescence.
Ensuite, pour effectuer des traitements éliminatoires ou chimiques, coupez les racines secondaires en morceaux d’un centimètre et placez environ 100 milligrammes sur gélose HRG en tas. Saturez ensuite le tas avec 80 microlitres de la solution de traitement appropriée et laissez la plaque incuber à température ambiante. Après 24 heures, pour l’extraction de l’ARN, tamponnez rapidement les racines sèches sur une serviette en papier stérilisée et récoltez-les directement dans un tube microcentrifuge de deux millilitres.
Scellez immédiatement le haut du tube à l’aide d’un parafilm et faites deux petits trous à l’aide d’une pince pointue. Les résultats de la PCR de la colonie de l’Agrobacterium transformée sont montrés. Les colonies positives en PCR indiquaient le gène d’intérêt.
Cependant, un tiers à la moitié des colonies étaient négatives pour le dépistage du gène virD2. La microscopie à fluorescence démontre la localisation subcellulaire de GFP-GmJAZ1-6. L’analyse de l’expression génique a confirmé la surexpression du facteur de transcription de la glycéolline GmHSF6-1 et le silençage de l’ARNi de GmMYB2912 dans les racines de Williams 82.
