Commencez par transférer une fraction brute d’un millilitre de mitochondries RAW 264,7 dans un tube conique de 15 millilitres. Ajouter 7 millilitres de tampon mitochondrial salé complété par 150 millimolaires de chlorure de sodium. À la suspension, ajoutez 50 microlitres de billes TOM22 puis incuber le tube sur une roue rotative à basse vitesse.
Placez une colonne sur l’aimant et équilibrez la colonne avec huit millilitres de tampon mitochondrial salé. Jetez le flux continu. Après l’incubation de l’échantillon, transférez-le dans la colonne et jetez l’écoulement.
Ensuite, lavez la colonne trois fois avec huit millilitres de tampon mitochondrial salé. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube conique de 15 millilitres. Pour éluer les mitochondries, ajoutez 1,5 millilitre de tampon mitochondrial salé et appliquez immédiatement un piston pour éluer la fraction purifiée dans le tube.
Transférer la fraction éluée dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et effectuer une centrifugation à 21 000 G pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Jetez le surnageant formé et stockez la pastille mitochondriale pure brune à 20 degrés Celsius pour des études futures. L’analyse immunoblot des extraits mitochondriaux purifiés a montré un enrichissement en citrate synthase mitochondriale et un épuisement des protéines d’autres organites cellulaires.
Des études d’intégrité mitochondriale utilisant la microscopie électronique ont révélé des mitochondries avec une forme ovale classique et des cristae intactes entourées de billes enrobées d’anticorps denses en électrons. En outre, l’analyse du protéome a montré un enrichissement des protéines mitochondriales et de deux populations distinctes correspondant à des protéines mitochondriales et non mitochondriales.
