Pour commencer, inoculez Limosilactobacillus reuteri DSM20016 du stock de glycérol dans six millilitres de bouillon De Man, Rogosa, Sharpe ou MRS, dans un tube de 50 millilitres. Incuber la culture en aérobiose pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur statique. Le lendemain, inoculez quatre millilitres de la culture de nuit dans 200 millilitres de bouillon MRS.
Permettre à la culture de croître en aérobiose dans un incubateur statique de 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 0,5 à 0,85. Ensuite, décantez la culture dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres et placez-les sur de la glace tout en équilibrant les tubes. Centrifuger la culture dans une centrifugeuse pré-réfrigérée et jeter le surnageant.
Avant de remettre le granulé en suspension dans 50 millilitres d’eau distillée double prérefroidie, répétez la centrifugation deux fois. Après la dernière centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 25 millilitres d’eau distillée double, 0,5 molaire de saccharose et 10% de glycérol. Centrifuger la suspension cellulaire, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans deux millilitres d’eau distillée double, 0,5 molaire de saccharose et 10% de glycérol sur glace.
Aliquote la suspension en portions de 50 à 100 microlitres dans des tubes microcentrifuges prérefroidis et stocker les tubes à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Ensuite, pour l’électroporation, décongeler une partie aliquote de cellules électrocompétentes sur de la glace. Mélanger cinq à 10 microlitres du plasmide dans l’aliquote décongelée en évitant autant que possible de pipeter.
Transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation d’un millilitre refroidie par glace et électroporate à 1,25 kilovolts, 400 ohms et 25 microfarads. Après électroporation, ajouter un millilitre de bouillon MRS et mélanger en retournant la cuvette une ou deux fois. Placez les cuvettes dans un incubateur statique à 37 degrés Celsius pendant 2,5 à trois heures pour la récupération.
Ensuite, plaquez la suspension entière sur plusieurs plaques de tarière MRS avec la sélection appropriée. Placez les assiettes à l’intérieur d’un récipient hermétique avec une petite bougie allumée dans une atmosphère anaérobie générant un sachet. Croître à 37 degrés Celsius pendant deux à trois jours ou jusqu’à ce que des colonies visibles apparaissent.
L’électroporation de L.reuteri avec le plasmide constitutif mCherry2 produisant pTRKH3 donne des efficacités de transformation d’environ cinq à huit colonies par 200 microlitres plaqués, quelle que soit la condition de méthylation plasmidique. La transformation avec pNZ123 ne portant aucune protéine rapporteure constitutive exogène a donné des efficacités de transformation de trois fois 10 à quatre UFC par microgramme d’ADN.
