Après clonage du peptide de nucléation de la vésicule, ou étiquette de séquence VNP, à la borne aminée de la protéine de fusion, cultivez un bouillon de lysogénie de cinq millilitres, ou démarreurs LB, à partir de transformations bactériennes fraîches à 37 degrés Celsius jusqu’à saturation. Ensuite, utilisez-le pour inoculer 25 millilitres de bouillon formidable, ou TB, contenant une sélection appropriée d’antibiotiques dans une fiole conique de 500 millilitres. Incuber le ballon dans un incubateur à 37 degrés Celsius tout en agitant à 200 rotations par minute ou plus que l’équivalent d’une projection orbitale de 25 millimètres jusqu’à ce que la culture atteigne une valeur de densité optique de 600 nanomètres, ou OD 600, de 0,8 à 1,0.
Ensuite, induisez l’expression de protéines recombinantes à partir du promoteur T7 en ajoutant IPTG à une concentration finale allant jusqu’à 20 microgrammes par millilitre ou 84 micromolaires. Après avoir laissé suffisamment de temps pour l’induction, pelleter les cellules par centrifugation à 3000 G à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes. Passez le surnageant à travers un filtre PES de 0,45 micron stérile et sans détergent pour stériliser le milieu contenant la vésicule pour un stockage à long terme.
Pour concentrer les vésicules dans un volume plus petit, passez le média contenant la vésicule stérile à travers un filtre MCE stérile et sans détergent de 0,1 micron. Ensuite, lavez doucement la membrane avec 0,5 à 1 millilitre de solution saline tamponnée au phosphate stérile, ou PBS, et utilisez un grattoir cellulaire ou un épandeur en plastique pour retirer soigneusement les vésicules de la membrane. Transférer le concentré de vésicules dans un tube microcentrifuge frais à l’aide d’une pipette.
Les vésicules purifiées peuvent être conservées à quatre degrés Celsius. Sonicer la protéine contenant les vésicules dans le milieu stérile en utilisant un calendrier approprié pour perturber les membranes lipidiques vésiculaires et libérer de la protéine. Centrifuger la suspension soniquée à 39 000 G et 4 degrés Celsius pendant 20 minutes pour éliminer les débris vésiculeux.
BL21DE3 Escherichia coli contenant la construction d’expression VNp6-mNeongreen a montré une fluorescence mNeongreen induite pendant la nuit avec IPTG. La fluorescence est restée visible dans la culture après l’élimination des cellules bactériennes par centrifugation. La présence de VNp-mNeongreen dans la culture dans les milieux de culture défrichés a été confirmée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium.
Les vésicules purifiées en suspension dans le PBS présentaient également une fluorescence.
