Les auteurs remercient les divers utilisateurs de Twitter qui ont soulevé des questions sur le protocole présenté dans l’article décrivant la technologie VNp. La figure 1A a été générée à l’aide d’icônes de flaticon.com. Ces travaux ont été financés par l’Université du Kent et financés par le Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques (BB/T008/768/1 et BB/S005544/1).

Les travaux bactériens entrepris respectent les règlements locaux, nationaux et internationaux sur le confinement de la biosécurité adaptés au niveau de risque de biosécurité particulier de chaque souche.
1. Sélection de différents VNps
<ol><li>Identifiez les séquences VNp. REMARQUE : Pour la présente étude, trois séquences VNp ont été identifiées1 qui entraînent un rendement maximal et une exportation vésiculeuse des protéines examinées à ce jour : VNp2, VNp6 et VNp15. Il n’est pas clair actuellement pourquoi certaines variantes de VNp fonctionnent plus efficacement avec certaines protéines que d’autres; par conséquent, il est recommandé de générer des fusions entre une nouvelle protéine d’intérêt avec chaque variante de VNp (c.-à-d. VNp2, 6 ou 15). VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA AGKTKEGVL VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA AEKTKEGVM VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE Des plasmides qui permettent l’expression de la protéine d’intérêt avec différentes fusions terminales d’amino VNp ont été commercialisés (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Concevoir une stratégie de clonage pour insérer le gène d’intérêt à l’extrémité 3' de l’ADNc codant pour le VNp dans l’une de ces constructions, ou adapter un plasmide existant en intégrant l’ADNc VNp synthétisé en amont du premier codon ATG du gène codant pour la protéine d’intérêt. Utilisez les méthodes décrites aupoint 1.</li>
	<li>Pour les protéines toxiques, utilisez un vecteur avec un promoteur d’expression répressible ou un promoteur avec un bruit d’expression non induit minimal.</li>
	<li>Cloner l’étiquette de séquence VNp au niveau de l’amino-terminal de la protéine de fusion. Assurez-vous que les étiquettes d’affinité, les séquences de clivage de la protéase, etc., et la protéine d’intérêt sont situées du côté carboxyle de l’étiquette VNp. Il est recommandé de séparer le VNp du peptide en aval avec une région de liaison flexible, telle que deux ou trois répétitions d’une séquence polypeptidique -G-G-S-G- (Figure 1). REMARQUE: Utilisez des plasmides avec une sélection d’antibiotiques qui ne cible pas le peptidoglycane, ce qui affaiblit la surface cellulaire et réduit le rendement des vésicules. La kanamycine et le chloramphénicol (voir le tableau des matières) étaient les antibiotiques préférés utilisés dans cette étude.</li>
</ol>2. Culture cellulaire bactérienne et induction de protéines
NOTE: Les souches bactériennes généralement utilisées dans ce protocole sont Escherichia coli BL21 (DE3) ou W3110. Les cellules d’E. coli sont cultivées dans un bouillon de lysogénie (LB) (10 g/L de tryptone; 10 g/L de NaCl; extrait de levure de 5 g/L) ou d’un bouillon formidable (TB) (12 g/L de tryptone; 24 g/L d’extrait de levure; 4 mL/L de glycérol à 10 %; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, sels autoclavés séparément) (voir le tableau des matières). Des exemples d’images montrant chaque étape de l’induction de la protéine et le processus ultérieur d’isolement et de purification sont présentés à la figure 2.
<ol><li>Cultivez des démarreurs de 5 mL LB à partir de transformations bactériennes fraîches à 37 °C jusqu’à saturation et utilisez-les pour inoculer 25 mL de TB dans une fiole conique de 500 mL, le tout avec une sélection appropriée d’antibiotiques.</li>
	<li>Le rapport surface/volume est un facteur important dans l’optimisation de ce système. Utiliser une fiole aussi grande que possible (p. ex., fiole de 5 L contenant 1 L de culture; pour les cycles d’optimisation, utiliser 25 mL de média dans une fiole de 500 mL).</li>
	<li>Incuber les plus grandes cultures de flacons agités dans un incubateur à 37 °C avec agitation à 200 tr/min (≥25 mm de projection orbitale) jusqu’à ce qu’une valeur de densité optique de 600 nm (OD600) de 0,8-1,0 soit atteinte. NOTE: La vésiculation est optimale lorsque les cellules sont cultivées à 37 ° C. Cependant, certaines protéines recombinantes nécessitent une expression à des températures plus basses. Si tel est le cas pour la protéine d’intérêt, l’étiquette VNp6 doit être utilisée, car elle permet l’exportation de vésicules à haut rendement à des températures allant jusqu’à 25 ° C.</li>
	<li>Pour induire l’expression de protéines recombinantes à partir du promoteur T7, ajouter l’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale allant jusqu’à 20 μg/mL (84 μM) (voir le tableau des matériaux). L’induction de l’expression de protéines recombinantes doit se produire à la phase logarithmique tardive (c.-à-d. OD600 typique de 0,8-1,0) pour la production de vésicules. REMARQUE: La durée de la période d’induction peut varier d’une protéine à l’autre, certaines atteignant une production maximale à 4 heures et d’autres pendant la nuit (18 heures). À ce jour, l’exportation maximale de vésicules a été obtenue dans les cultures de nuit.</li>
</ol>3. Isolement des vésicules recombinantes
<ol><li>Enduire les cellules par centrifugation à 3 000 x g (4 °C) pendant 20 min.</li>
	<li>Pour stériliser les milieux contenant des vésicules en vue d’un stockage à long terme, faire passer le milieu de culture dégagé dans un filtre en polyéthersulfone (PES) de 0,45 μm stérile et sans détergent (voir le tableau des matériaux). NOTE: Pour tester l’exclusion des cellules viables du filtrat contenant des vésicules, plaquer sur gélose LB et incuber pendant une nuit à 37 °C.</li>
	<li>Pour concentrer les vésicules dans un plus petit volume, faire passer le milieu stérile contenant des vésicules à travers un filtre stérile d’esters cellulosiques mixtes (ECM) de 0,1 μm (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Lavez doucement la membrane avec 0,5 à 1 mL de PBS stérile à l’aide d’un grattoir cellulaire ou d’un épandeur en plastique pour retirer soigneusement les vésicules de la membrane. Transférer dans un tube microfuge neuf. REMARQUE: Les vésicules purifiées peuvent être conservées dans un milieu stérile ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C. Il existe des exemples de protéines recombinantes stockées dans ces vésicules pendant 6 mois, de cette façon, sans perte d’activité enzymatique.</li>
</ol>4. Libération de protéines solubles par les vésicules isolées
<ol><li>Une fois que les vésicules contenant des protéines ont été isolées dans le milieu stérile/tampon, soumettre les membranes lipidiques vésiculaires à la sonication en utilisant un calendrier approprié pour l’appareil (p. ex. 6 x 20 s sur et hors cycles) et centrifuger à 39 000 x g (4 °C) pendant 20 minutes pour enlever les débris vésiculaires. NOTE: Le choc osmotique ou le traitement détergent peut être utilisé comme alternative pour briser les vésicules, mais il faut tenir compte de l’impact sur la fonctionnalité des protéines et / ou l’application en aval.</li>
	<li>Si la fusion VNp reste cytosolique et ne se libère pas dans le milieu, isoler la protéine à l’aide de protocoles standard (p. ex., remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 5 mL d’un tampon d’extraction approprié (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonifier et enlever les débris cellulaires par centrifugation).</li>
</ol>5. Détermination de la concentration en protéines
<ol><li>Déterminer la concentration de protéines par analyse par gel densitométrique d’échantillons triplicates1. Appliquer les normes de charge en albumine sérique bovine (BSA) sur les gels d’électrophorèse en polyacrylamide de sodium dodécylsulfate colorés à la coomassie (SDS-PAGE). Numériser et analyser les gels à l’aide d’un logiciel approprié (p. ex., image J; voir le tableau des matériaux).</li>
</ol>6. Visualisation de la formation des vésicules et des vésicules isolées par microscopie à fluorescence
REMARQUE: Si les cellules contiennent des marqueurs de fusion VNp ou de membrane marqués par fluorescence, l’imagerie de cellules vivantes peut être utilisée pour suivre la formation de vésicules. Alternativement, des colorants lipidiques fluorescents peuvent être utilisés pour visualiser les vésicules afin de confirmer la production et la purification.
<ol><li>Montage de cellules<ol><li>Induisez l’expression de fusion VNp pendant plusieurs heures avant de monter sur la lame.</li>
		<li>Méthode du tampon d’agarose (figure 3A-C) : pipeter les cellules sur un tampon LB-agarose circulaire mince (<1 mm) (2%) qui a été laissé se former et fixé sur une lame de verre propre. Laissez les cellules se déposer et s’équilibrer et placez une lame de couverture de 50 mm x 25 mm sur le tampon et les cellules. Maintenez le couvercle en place avec des entretoises et du ruban adhésif.</li>
		<li>Méthode à la polyéthylèneimine (PEI) (figure 3D-F) : étaler 20 μL de PEI à 0,05 % (endH2O) sur une lamelle de couverture à l’aide d’une pointe de pipette et laisser agir 3 à 5 min pour se lier au verre sans laisser sécher. Ajouter 50 μL de culture cellulaire et laisser agir pendant 5 à 10 minutes pour s’assurer que les bactéries se sont associées à la surface recouverte d’Île-du-Prince-Édouard4. Lavez la lamelle de couverture avec 100 μL de média avant de la placer sur la lame et maintenez-la en place avec des entretoises et du ruban adhésif.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage des vésicules<ol><li>Pipette vésicules purifiées sur un mince tampon (<1 mm) circulaire LB-agarose (2%) qui a été laissé se former et fixé sur une lame de verre propre. Une fois le liquide séché, placez une glissière de couverture de 50 mm x 25 mm sur le tampon et les vésicules. Maintenez le couvercle en place avec des entretoises et du ruban adhésif.</li>
		<li>Le colorant lipidique fluorescent FM4-64 est capable de colorer les membranes5, et peut donc être utilisé pour visualiser les vésicules. Ajouter FM4-64 (voir le tableau des matières) aux vésicules purifiées à une concentration finale de 2 μM (à partir d’un stock de 2 mM dissous dans du diméthylsulfoxyde [DMSO]) et imager après une incubation de 10 minutes. Ceci est particulièrement utile pour identifier les vésicules contenant des cargaisons non marquées par fluorescence5.</li>
		<li>Rincer les lamelles de couverture avec le même milieu que celui utilisé pour cultiver les cellules observées. REMARQUE : Certains milieux complexes (p. ex., la tuberculose) peuvent présenter une autofluorescence, ce qui peut entraîner un excès de signal de fond.</li>
	</ol></li>
	<li>Vésicules d’imagerie REMARQUE : Des exemples d’images microscopiques de vésicules recombinantes VNp sont présentés à la figure 4.<ol><li>Montez la lame sur un microscope inversé (voir Tableau des matériaux) à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile et laissez reposer 2-3 minutes pour permettre à l’échantillon de se déposer et à la température de s’équilibrer. REMARQUE : Toutes les images de cellules vivantes pour chaque échantillon doivent être effectuées dans les 30 minutes suivant le montage des cellules sur des lames de couverture afin de minimiser l’impact de la phototoxicité et du stress anaérobie. Pour cette raison, les images à plan unique sont préférées aux piles z.</li>
		<li>Utiliser des sources lumineuses appropriées (p. ex. diode électroluminescente [DEL] ou ampoule halogène; voir le tableau des matériaux) et des combinaisons de filtres pour la ou les protéines fluorescentes/colorants utilisés6.</li>
		<li>Utilisez une lentille à fort grossissement (c.-à-d. 100x ou 150x) et à grande ouverture numérique (c.-à-d. NA ≥1,4) pour imager les cellules microbiennes et les vésicules.</li>
		<li>Déterminer l’intensité lumineuse minimale requise pour visualiser les signaux de fluorescence des cellules et / ou des vésicules. Cela peut nécessiter un certain ajustement des paramètres d’exposition et de gain pour l’appareil photo utilisé. REMARQUE: Les temps d’exposition typiques des caméras CMOS (complementary metal-oxide semiconductor) actuelles varient entre 50 et 200 ms selon le système d’imagerie.</li>
		<li>Pour les images à image unique, utilisez la moyenne à trois images pour réduire le bruit de fond aléatoire dépendant du matériel.</li>
		<li>Pour l’imagerie accélérée, prévoyez 3 à 5 minutes entre les images individuelles. REMARQUE: Selon la configuration du microscope, la mise au point peut avoir besoin d’être ajustée par intermittence au cours d’expériences plus longues.</li>
	</ol></li>
</ol>

Production et imagerie de vésicules remplies de protéines recombinantes à partir d’E. coli

<ol>
	<li>Eastwood, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+vesicle-packaged+recombinant+protein+production+from+E.+coli.">High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli.</a> Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).</li><li>Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+engineering+for+improved+expression+of+recombinant+proteins+in+bacteria.">Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria.</a> Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+recombinant+protein+secretion+efficiency+in+gram-positive+bacteria:+Signal+peptide+and+beyond.">Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).</li><li>Lewis, K., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+nature:+rational+design+of+sterile-surface+materials.">Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials.</a> Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).</li><li>Mulvihill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+in+fission+yeast.">Live cell imaging in fission yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift,+red-shifted+fluorescence,+and+low+cytotoxicity.">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).</li><li>Periz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+dynamic+F-actin+network+regulates+transport+and+recycling+of+micronemes+in+Toxoplasma+gondii+vacuoles.">A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles.</a> Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+patchy+and+hollow+rectangular+platelet+micelles+from+crystallizable+polymer+blends.">Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends.</a> Science. 352 (6286), 697-701 (2016).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent ou autre conflit d’intérêts.

La méthode de peptide amino-terminal marqué pour la production de protéines recombinantes décrite ci-dessus est un processus simple, qui produit constamment de grandes quantités de protéines qui peuvent être efficacement isolées et / ou stockées pendant des mois.
Il est important de souligner les étapes clés du protocole qui sont nécessaires pour une utilisation optimale de ce système. Tout d’abord, la balise VNp1 doit être située à l’extrémité N, suivie de la protéine d’intérêt et de toute étiquette appropriée. Il est également important d’éviter d’utiliser des antibiotiques qui ciblent la couche de peptidoglycane, tels que l’ampicilline.
En termes de conditions de croissance, des milieux riches (par exemple, LB ou TB) et un rapport surface/volume élevé sont nécessaires pour maximiser la production de vésicules. La température optimale pour la production de vésicules extracellulaires est de 37 °C, mais les conditions généralement requises pour l’expression de la protéine d’intérêt doivent également être prises en compte. Pour des températures d’induction plus basses, VNp6 doit être utilisé. Fondamentalement, l’induction du promoteur T7 doit être réalisée en utilisant pas plus de 20 μg/mL (84 μM) IPTG une fois que les cellules atteignent une OD600 de 0,8-1,0. Les protéines exprimées à l’aide du système atteignent la production maximale de vésicules à 4 h ou après une induction nocturne.
Malgré la simplicité de ce protocole, il nécessite une optimisation. La fusion des variantes VNp, les températures d’expression et les périodes d’induction peuvent différer en fonction de la protéine d’intérêt. En outre, il est nécessaire d’optimiser la purification et la concentration ultérieure des vésicules extracellulaires du milieu. La procédure actuelle n’est pas évolutive et peut prendre beaucoup de temps. Ce sont les limites de cette méthodologie.
La technologie VNp présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnelles2. Il permet l’exportation vésiculeuse de diverses protéines, la taille maximale exprimée avec succès à ce jour étant de 175 kDa pour les vésicules qui restent internes et de 85 kDa pour celles qui sont exportées. En outre, cette technologie peut augmenter considérablement le rendement des protéines recombinantes avec une gamme de propriétés physiques et d’activités. Les vésicules exportées contenant la protéine d’intérêt peuvent être isolées par simple filtration à partir du milieu préautorisé et peuvent ensuite être stockées, dans des milieux de culture stériles ou tampons, à 4 °C pendant plusieurs mois.
Les applications de ce système sont diverses, de la science de la découverte à la biotechnologie appliquée et à la médecine (p. ex., par la production de thérapies fonctionnelles)3. La facilité de production, la transformation en aval et le rendement élevé sont autant de qualités attrayantes dans ces domaines et en particulier dans l’industrie.

La bactérie à Gram négatif E. coli est un système attrayant pour la production de protéines recombinantes à l’échelle industrielle et académique. Il est non seulement rentable et simple à cultiver en lots à haute densité, mais un large spectre de réactifs, de souches, d’outils et de promoteurs a été établi pour favoriser la génération de protéines fonctionnelles dans E. coli1. De plus, les techniques de biologie synthétique surmontent maintenant les obstacles généralement liés à l’application de modifications post-traductionnelles et au repliement de protéines complexes2. La capacité de cibler la sécrétion de protéines recombinantes dans les milieux de culture est intéressante pour améliorer le rendement et réduire les coûts de fabrication. L’emballage contrôlé de protéines définies par l’utilisateur dans des vésicules membranaires contribue au développement de produits et de technologies dans les industries de la biotechnologie appliquée et de la médecine. Jusqu’à présent, il y avait un manque de méthodes largement applicables pour sécréter des protéines recombinantes à partir d’E. coli 3.
Eastwood et coll. ont récemment mis au point une méthode basée sur le marquage peptidique pour produire et isoler des vésicules contenant des protéines recombinantes à partir d’E. coli1. Ce peptide de nucléation des vésicules (VNp) permet la production de vésicules membranaires bactériennes extracellulaires, dans lesquelles la protéine recombinante de choix peut être ciblée pour simplifier la purification et le stockage de la protéine cible, et permet des rendements nettement plus élevés que ceux normalement autorisés par des cultures de flacons agités. Des rendements de près de 3 g de protéines recombinantes par litre de culture en flacon ont été rapportés, avec des rendements > 100 fois supérieurs à ceux obtenus avec des protéines équivalentes dépourvues du marquage VNp. Ces vésicules enrichies en protéines recombinantes peuvent être rapidement purifiées et concentrées à partir des milieux de culture et fournir un environnement stable pour le stockage. Cette technologie représente une percée majeure dans la production de protéines recombinantes d’E. coli. Les vésicules compartimentent les protéines toxiques et contenant la liaison disulfure sous une forme soluble et fonctionnelle, et favorisent la purification simple, efficace et rapide des protéines fonctionnelles emballées dans les vésicules pour le stockage à long terme ou le traitement direct1.
Les principaux avantages de cette technologie par rapport aux techniques actuelles sont les suivants : 1) l’applicabilité à une gamme de tailles (1 kDa à >100 kDa) et de types de protéines; (2) faciliter la formation de liaisons disulfures inter- et intra-protéiques; 3° applicable aux complexes multiprotéiques; (4) peut être utilisé avec une gamme de promoteurs et de souches standard d’E. coli de laboratoire; 5) la production de rendements en protéines à partir de flacons agités normalement observés uniquement avec des cultures de fermentation; les protéines sont exportées et emballées dans des vésicules liées à la membrane qui (6) fournissent un environnement stable pour le stockage de la protéine soluble active; et (7) simplifie le traitement en aval et la purification des protéines. Cet outil de protéines recombinantes simple et rentable est susceptible d’avoir un impact positif sur les industries biotechnologiques et médicales, ainsi que sur la science de la découverte.
Ici, un protocole détaillé, développé sur plusieurs années, décrit les conditions optimales pour produire des vésicules remplies de protéines recombinantes à partir de bactéries avec la technologie VNp. Des exemples d’images de ce système dans la pratique sont montrés, avec une protéine fluorescente exprimée, permettant de visualiser la présence de vésicules à différentes étapes de la production, de la purification et de la concentration. Enfin, des conseils sont fournis sur la façon d’utiliser l’imagerie de cellules vivantes pour valider la production de vésicules contenant la fusion VNp à partir des bactéries.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Acros Organics (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH10&#946;</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for microscope</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Molecular Probes (Invitrogen)</td>
			<td>T-3166</td>
			<td>Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open Source</td>
			<td></td>
			<td>Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Gibco (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>11815-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source for micrscope</td>
			<td>Cairn Research Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB) / LB agar</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane filter (0.1 &#181;m, MCE)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VCWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 &#181;m, PES)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HPWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized production and analysis of recombinant protein-filled vesicles from e. coli

Ce système innovant, utilisant un marqueur peptidique court, qui exporte plusieurs protéines recombinantes dans des vésicules liées à la membrane à partir d’E. coli, fournit une solution efficace à une gamme de problèmes associés à l’expression bactérienne des protéines recombinantes. Ces vésicules recombinantes compartimentent les protéines dans un micro-environnement qui facilite la production de protéines autrement difficiles, toxiques, insolubles ou contenant des liaisons disulfures à partir de bactéries. Le rendement en protéines est considérablement augmenté par rapport à l’expression bactérienne typique en l’absence de l’étiquette peptidique nucléant les vésicules. La libération de protéines emballées par vésicules favorise l’isolement du milieu de culture et permet le stockage à long terme des protéines actives. Cette technologie donne lieu à des rendements accrus de protéines fonctionnelles emballées dans des vésicules pour un traitement simplifié en aval pour un large éventail d’applications allant de la biotechnologie appliquée à la science de la découverte et à la médecine. Dans le présent article et la vidéo associée, un protocole détaillé de la méthode est fourni, qui met en évidence les étapes clés de la méthodologie pour maximiser la production de vésicules remplies de protéines recombinantes.

The Gram-negative bacteria E. coli is an attractive system for recombinant protein production on both industrial and academic scale. It is not only cost-effective and straightforward to culture in batches to high densities, but a broad-spectrum of reagents, strains, tools, and promoters have been established to promote the generation of functional proteins in E. coli1. Additionally, synthetic biology techniques are now overcoming obstacles typically related to the application of post-translational modifications and folding of complex proteins2. The ability to target the secretion of recombinant proteins into culture media is attractive for improving yield and reducing manufacturing costs. Controlled packaging of user-defined proteins into membrane vesicles assists the development of products and technologies within the applied biotechnology and medical industries. Until now, there has been a lack of widely applicable methods for secreting recombinant proteins from E. coli 3.
Eastwood et al.&#160;have recently developed a peptide tagging-based method for producing and isolating recombinant protein-containing vesicles from E. coli1. This Vesicle Nucleating peptide (VNp) allows the production of extracellular bacterial membrane vesicles, into which the recombinant protein of choice can be targeted to simplify purification and storage of the target protein, and allows significantly higher yields than normally allowed from shaking flask cultures. Yields of close to 3 g of recombinant protein per liter of flask culture have been reported, with &#62;100x higher yields than those obtained with equivalent proteins lacking the VNp tag. These recombinant protein-enriched vesicles can be rapidly purified and concentrated from the culture media and provide a stable environment for storage. This technology represents a major breakthrough in E. coli recombinant protein production. The vesicles compartmentalize toxic and disulfide-bond containing proteins in a soluble and functional form, and support the simple, efficient, and rapid purification of vesicle-packaged, functional proteins for long-term storage or direct processing1.
The major advantages this technology presents over current techniques are: (1) the applicability to a range of sizes (1 kDa to &#62;100 kDa) and types of protein; (2) facilitating inter- and intra- protein disulfide-bond formation; (3) applicable&#160;to multiprotein complexes; (4) can be used with a range of promoters and standard lab E. coli strains; (5) the generation of yields of proteins from shaking flasks normally only seen with fermentation cultures; proteins are exported and packaged into membrane bound vesicles that (6) provide a stable environment for storage of the active soluble protein; and (7) simplifies downstream processing and protein purification. This simple and cost-effective recombinant protein tool is likely to have a positive impact on the biotechnology and medical industries, as well as discovery science.
Here, a detailed protocol, developed over several years, describes the optimal conditions to produce recombinant protein-filled vesicles from bacteria with the VNp technology. Example images of this system in practice are shown, with a fluorescent protein being expressed, allowing the presence of vesicles during different stages of the production, purification, and concentration to be visualized. Finally, guidance is provided on how to use live cell imaging to validate the production of VNp fusion-containing vesicles from the bacteria.

Pleins feux sur l’auteur : La production de protéines recombinantes 

Production et analyse optimisées de vésicules remplies de protéines recombinantes à partir d’E. coli

We are trying to understand the dynamic interactions between molecules within living cells. For biochemical analysis, it can be necessary to use large quantities of recombinant protein. These can be extremely difficult to express in a correctly-folded and functional form.If a protein was found to be misfolded or insoluble when expressed in bacteria, researchers would either have to resort to mammalian cells, which is expensive and relatively slow, or use synthetic polypeptides. Our protocol allows for high yield expression as well as export of challenging proteins from E.coli. Adding a short cleavable peptide sequence to the amino terminus of the protein not only enhances the production and yield of every protein we have tested to date, but also exports the protein from the cell into the media.Along with simplifying protein expression, it also simplifies downstream protein purification.

BL21 DE3 E. coli contenant la construction d’expression VNp6-mNeongreen ont été cultivés jusqu’à la phase logarithmique tardive (figure 2A). L’expression de VNp6-mNeongreen a été induite par l’ajout d’IPTG à la culture (concentration finale de 20 μg/mL ou 84 μM), qui a ensuite été laissée croître pendant la nuit à 37 °C avec agitation vigoureuse (200 tr/min, ≥25 mm de projection orbitale). Le lendemain matin, la culture présentait une fluorescence mNeongreen7 (Figure 2B), qui est restée visible dans le milieu après l’élimination des cellules bactériennes par centrifugation (Figure 2C). La présence de VNp-mNeongreen dans les milieux de culture et de culture défrichés a été confirmée par SDS-PAGE (figure 2D). Les vésicules contenant du vert mnéonvert ont été isolées sur un filtre MCE de 0,1 μm (figure 2E) et remises en suspension dans du PBS (figure 2F). Les vésicules purifiées ont ensuite été montées sur un tampon d’agarose (figure 3A-C) et imagées par microscopie à fluorescence à grand champ (figure 4A). La présence de vésicules a été confirmée à l’aide du colorant fluorescent lipophile FM4-64 (figure 4B). Les cellules E. coli exprimant la protéine de membrane interne CydB fusionnée à mNeongreen (vert) et VNp6-mCherry2 (magenta)8 montrent la production de vésicules et l’insertion de cargaison dans des cellules bactériennes vivantes (Figure 4C). Les figures 4A,B ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ, tandis que la figure 4C a été acquise à l’aide de la microscopie à illumination structurée (SIM), en utilisant les méthodes décrites précédemment 9,10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig01.jpg"> Figure 1 : Résumé de la technologie VNp depuis la conception d’une stratégie de clonage jusqu’à la purification et le stockage des vésicules extracellulaires. (A) Schéma d’une protéine de fusion VNp typique. VNp à l’extrémité NH2, suivi d’un agent de liaison flexible et d’une combinaison appropriée de marqueurs d’affinité et de fluorescence (Tag1, Tag 2, site de clivage de la protéase [p. ex., TEV]) et de protéines d’intérêt. (B) Schéma de principe résumant le protocole d’expression et de purification des vésicules membranaires remplies de protéines recombinantes à partir d’E. coli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig02.jpg"> Figure 2 : Étapes de production et de purification des vésicules VNp6-mNg. Les cultures de cellules E. coli contenant l’expression VNp-mNeongreen se construisent en lumière bleue avant (A) ou après (B) l’expression induite par IPTG de la protéine de fusion. Les cellules de (B) ont été retirées par centrifugation, laissant des vésicules remplies de VNp-mNeongreen dans le milieu (C). (D) Des échantillons équivalents de A, B et C ont été analysés par FDS-PAGE et coloration coomossie. Les vésicules ont été isolées sur un filtre de 0,1 μm (E) et ensuite lavées dans un volume approprié de tampon (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig03.jpg"> Figure 3 : Procédure de montage des cellules pour l’imagerie des vésicules et la production de vésicules. (A-C) La méthode du tampon d’agarose et (D-F) la méthode PEI pour le montage des cellules d’E. coli sur la lamelle de couverture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig04.jpg"> Figure 4 : Images microscopiques des vésicules recombinantes VNp. Images d’émission vertes (A) et rouges (B) provenant de différents champs de vésicules contenant du VNp6-mNeongreen marquées VNp6-mNeongreen montées sur un tampon d’agarose. (C) L’imagerie des cellules d’E. coli exprimant la protéine de membrane interne CydB fusionnée à mNeongreen (vert) et VNp6-mCherry2 (magenta) montre la production de vésicules et l’insertion de cargaison dans les cellules bactériennes vivantes. (A, B) ont été imagés à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ, tandis que (C) a été acquis à l’aide de la microscopie à illumination structurée (SIM). Barres d’échelle: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Le présent protocole décrit une méthode détaillée pour la production bactérienne de protéines recombinantes, y compris des protéines typiquement insolubles ou contenant des liaisons disulfures, emballées à l’intérieur de vésicules extracellulaires liées à la membrane. Cela a le potentiel d’être appliqué à des domaines polyvalents de la recherche scientifique, y compris la biotechnologie appliquée et la médecine.

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Nous essayons de comprendre les interactions dynamiques entre les molécules au sein des cellules vivantes. Pour l’analyse biochimique, il peut être nécessaire d’utiliser de grandes quantités de protéines recombinantes. Ceux-ci peuvent être extrêmement difficiles à exprimer sous une forme correctement pliée et fonctionnelle.Si une protéine s’avérait mal repliée ou insoluble lorsqu’elle était exprimée dans des bactéries, les chercheurs devraient soit recourir à des cellules de mammifères, ce qui est coûteux et relativement lent, soit utiliser des polypeptides synthétiques. Notre protocole permet une expression à haut rendement ainsi que l’exportation de protéines difficiles à partir d’E. coli. L’ajout d’une courte séquence peptidique clivable à l’extrémité aminée de la protéine améliore non seulement la production et le rendement de chaque protéine que nous avons testée à ce jour, mais exporte également la protéine de la cellule dans le milieu.En plus de simplifier l’expression des protéines, il simplifie également la purification des protéines en aval.

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Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

4.9K vues.  University of Kent. Nous essayons de comprendre les interactions dynamiques entre les molécules au sein des cellules vivantes. Pour l’analyse biochimique, il peut être nécessaire d’utiliser de grandes quantités de protéines recombinantes. Ceux-ci peuvent être extrêmement difficiles à exprimer sous une forme correctement pliée et fonctionnelle.Si une protéine s’avérait mal repliée ou insoluble lorsqu’elle était exprimée dans des bactéries, les chercheurs devraient soit recourir à de...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : La production de protéines recombinantes 

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an effective solution to a range of problems associated with bacterial recombinant protein expression. These recombinant vesicles compartmentalise proteins within a micro-environment that facilitates the production of otherwise challenging, toxic, insoluble, or disulfide-bond containing proteins from bacteria. Protein yield is increased considerably when compared to typical bacterial expression in the absence of the vesicle-nucleating peptide tag. The release of vesicle-packaged proteins supports isolation from the culture medium&#160;and permits long-term active protein storage. This technology gives rise to increased yields of vesicle-packaged, functional proteins for simplified downstream processing for a diverse range of applications from applied biotechnology to discovery science and medicine. In the present article and the associated video, a detailed protocol of the method is provided, which highlights key steps in the methodology to maximize recombinant protein-filled vesicle production.

The present protocol describes a detailed method for the bacterial production of recombinant proteins, including typically insoluble or disulfide-bond containing proteins, packaged inside extracellular membrane-bound vesicles. This has the potential to be applied to versatile areas of scientific research, including applied biotechnology and medicine.

Recherche

Biologie

Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein

After cloning the vesicle nucleating peptide, or VNP sequence tag, at the amino terminal of the fusion protein, culture a five-milliliter lysogeny broth, or LB starters, from fresh bacterial transformations at 37 degrees Celsius to saturation. Then, use that to inoculate 25 milliliters of terrific broth, or TB, containing appropriate antibiotic selection in a 500-milliliter conical flask. Incubate the flask in an incubator at 37 degrees Celsius while shaking at 200 rotations per minute or greater than equal to a 25-millimeter orbital throw until the culture reaches a 600-nanometer optical density value, or OD 600, of 0.8 to 1.0.Then, induce recombinant protein expression from the T7 promoter by adding IPTG to a final concentration of up to 20 micrograms per milliliter or 84 micromolar. After allowing sufficient time for induction, pellet the cells by centrifugation at 3000 G at 4 degrees Celsius for 20 minutes. Pass the supernatant through a sterile and detergent free 0.45 micron PES filter to sterilize the vesicle containing media for long-term storage.To concentrate the vesicles into a smaller volume, pass the sterile vesicle containing media through a sterile and detergent free 0.1 micron MCE filter. Then, gently wash the membrane with 0.5 to 1 milliliters of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, and use a cell scraper or plastic spreader to carefully remove vesicles from the membrane. Transfer the vesicle concentrate to a fresh micro centrifuge tube using a pipette.Purified vesicles can be stored at four degrees Celsius. Sonicate the protein containing vesicles in the sterile media using an appropriate schedule to disrupt the vesicular lipid membranes and release protein. Centrifuge the sonicated suspension at 39, 000 G and 4 degrees Celsius for 20 minutes to remove the vesicular debris.BL21DE3 Escherichia coli containing the VNp6-mNeongreen expression construct displayed mNeongreen fluorescence being induced overnight with IPTG. The fluorescence remained visible in the culture after the removal of bacterial cells by centrifugation. The presence of VNp-mNeongreen within the culture in cleared culture media was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.The resuspended purified vesicles in PBS also displayed fluorescence.

Isolement vesciculaire recombinant à partir d’une culture bactérienne pour libérer des protéines solubles

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy  

To stain the vesicle membrane, add the fluorescent lipid dye FM4-64 to the purified vesicles at a final concentration of two micromolar and incubate for 10 minutes before imaging. After isolating the protein filled vesicles from Escherichia coli culture, pipette the purified vesicles onto a less than one millimeter thin circular 2%LB agarose pad that has been allowed to form and set on a clean glass slide. Once the liquid has dried, place a 50 millimeter by 25 millimeter cover slip over the vesicles on the pad.Hold the cover slip in place with spacers and adhesive tape. Then mount the slide onto an inverted microscope using an oil immersion objective, and leave the sample for two to three minutes to settle and the temperature to equilibrate. For single frame images, use three image averaging to reduce hardware dependent random background noise.For time-lapse imaging, allow three to five minutes between individual frames. Widefield fluorescence microscopy imaging showed the purified amnion green containing vesicles. The lipophilic fluorescent dye, FM4-64, confirmed the presence of vesicle membranes.Structured illumination microscopy of the live bacterial cells expressing the inner membrane protein, CydB, fused to amnion green, and VNp6-mCherry2 showed vesicle production and cargo insertion.