Pour colorer la membrane de la vésicule, ajouter le colorant lipidique fluorescent FM4-64 aux vésicules purifiées à une concentration finale de deux micromolaires et incuber pendant 10 minutes avant l’imagerie. Après avoir isolé les vésicules remplies de protéines de la culture d’Escherichia coli, pipeter les vésicules purifiées sur un mince tampon d’agarose circulaire de 2% LB de moins d’un millimètre qui a été laissé se former et fixé sur une lame de verre propre. Une fois que le liquide a séché, placez un couvercle de 50 millimètres sur 25 millimètres sur les vésicules du tampon.
Maintenez le couvercle en place avec des entretoises et du ruban adhésif. Ensuite, montez la lame sur un microscope inversé à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile et laissez l’échantillon pendant deux à trois minutes pour se déposer et la température s’équilibrer. Pour les images à image unique, utilisez la moyenne de trois images pour réduire le bruit de fond aléatoire dépendant du matériel.
Pour l’imagerie accélérée, prévoyez trois à cinq minutes entre les images individuelles. L’imagerie par microscopie à fluorescence à grand champ a montré que les vésicules contenant du vert d’amnion purifié. Le colorant fluorescent lipophile, FM4-64, a confirmé la présence de membranes vésiculaires.
La microscopie à illumination structurée des cellules bactériennes vivantes exprimant la protéine de la membrane interne, CydB, fusionnée au vert d’amnion, et VNp6-mCherry2 a montré la production de vésicules et l’insertion de la cargaison.
