Pour commencer, portez un équipement de protection individuelle, y compris une protection oculaire, un masque chirurgical et des gants sans latex. Préparer 20 millilitres de neuroblastome de souris ou de cellules BHK-21 à une concentration de 3,0 fois 10 à la cinquième cellules par millilitre dans l’EGM. Conservez les cellules préparées au froid jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées.
Ensuite, préparez le virus CVS-11 en le diluant dans de l’EGM. Assurez-vous de garder le virus préparé au froid jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Nettoyez la chambre de la lame d’humidité et les lames de microscope à puits recouvertes de polytétrafluoroéthylène avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher à l’air libre dans l’enceinte de sécurité biologique.
Après le nettoyage, ajoutez de l’eau distillée aux bandes de papier absorbant dans la chambre de la lame pour assurer une humidité constante tout au long de la procédure. À l’aide d’un crayon, étiquetez chaque lame avec les informations d’identification requises, telles que le numéro de lot, la date et le type de cellule. Placez les lames étiquetées dans la chambre des lames pour les ranger.
Appliquez ensuite 50 microlitres de dilution virale sur les puits sur les lames de microscope à l’aide d’une pipette répétitive. Appliquez 50 microlitres de dilution cellulaire sur chaque puits, en faisant attention de ne pas contaminer l’embout de la pipette avec le virus déjà présent dans le puits. Ensuite, fermez la chambre de glissement d’humidité et placez-la dans l’incubateur humide entre 34 et 36 degrés Celsius.
Ensuite, retirez la lame de la chambre d’humidité et aspirez méticuleusement le surnageant. Lavez la lame pendant deux minutes dans un bocal rempli de PBS, puis laissez-la sécher à l’air libre. Placez la lame dans un pot de coplin rempli d’acétone froide pour fixer l’échantillon.
Placez le bocal dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius approuvé pour les matériaux inflammables pendant au moins une heure. Une fois que l’acétone s’évapore et que la lame sèche, appliquez un conjugué d’anticorps fluorescents directs contre la rage dans les puits de la lame et incubez la lame pendant 30 minutes dans un incubateur humide de 34 à 36 degrés Celsius. Ensuite, lavez la lame deux fois dans un pot de PBS pendant deux minutes chacune.
Séchez la lame à l’air libre et montez la lamelle de recouvrement avec le triss de 0,05 molaire, 0,15 molaire de chlorure de sodium dans un fixateur de glycérol à 20 %. Utilisez un microscope à fluorescence à un grossissement de 200 fois pour évaluer l’infectiosité cellulaire. Ensuite, retirez les lames restantes de l’incubateur et de la chambre d’humidité.
Aspirez soigneusement le surnageant de chaque puits. Placez ensuite les lames dans un bocal de coplin avec du PBS pendant une à deux minutes. Laissez les lames sécher à l’air libre pendant environ 30 minutes, puis rangez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation.
