Pour commencer, préparez la dilution dans les échantillons de sérum ou de liquide céphalo-rachidien du patient pour les tests. Préparez le conjugué requis à la concentration de travail appropriée en le diluant dans du PBS avec 0,05 % de bleu Evans. Pour les tests d’anticorps fluorescents indirects, récupérez le nombre approprié de lames d’antigène préparées requises pour le test.
Laissez les lames décongeler et sécher complètement. Ensuite, placez les lames dans un pot Coplin rempli d’acétone et transférez-les dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius approuvé pour les matériaux inflammables pendant deux heures à toute la nuit. Ensuite, retirez les lames de l’acétone et laissez-les sécher à l’air libre.
Maintenant, placez les lames dans la boîte de la chambre d’humidité à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique. Pour maintenir l’humidité, ajoutez des bandes absorbantes imbibées d’eau distillée dans la chambre. Appliquer 50 microlitres de chaque échantillon témoin, dilution de l’échantillon ou PBS dans le puits prédéterminé.
Placez la chambre de glissement d’humidité fermée à 37 degrés Celsius, incubateur d’humidité de dioxyde de carbone à 5% pendant 30 minutes. Une fois cela fait, retirez la chambre de glissement d’humidité de l’incubateur et transférez-la dans une enceinte de sécurité biologique. À l’aide d’un embout d’aspirateur, aspirer soigneusement le surnageant de chaque puits sans perturber la monocouche cellulaire.
Ensuite, appliquez une goutte de PBS sur chaque puits à l’aide d’une pipette compte-gouttes stérile. Aspirez soigneusement le PBS et transférez chaque lame dans un bocal Coplin rempli de PBS. Ensuite, replacez les lames dans la boîte de la chambre d’humidité.
Appliquez 50 microlitres du conjugué d’anticorps anti-humain approprié dans chaque puits et incubez pendant 30 minutes dans un incubateur humide. À la fin de l’incubation, transférez la chambre d’humidité dans une enceinte de sécurité biologique. Aspirer le surnageant à l’aide d’un embout d’aspirateur.
Ensuite, appliquez une goutte de PBS sur chaque puits à l’aide d’une pipette compte-gouttes stérile. Après avoir retiré le PBS, lavez la lame deux fois dans un pot Coplin de PBS pendant un total de 15 minutes. Une fois lavées, laissez les lames sécher à l’air libre, puis montez une lamelle de recouvrement avec du support de montage.
Prenez les lames et lisez-les sous microscopie à fluorescence. Classez les échantillons de négatif à quatre plus avec des échantillons négatifs ne montrant aucune fluorescence et quatre échantillons plus montrant une fluorescence vert vif. Attribuez les échantillons et la valeur de point final représentés par le facteur de dilution auquel l’échantillon affiche une teneur de un à deux plus.
Après la vaccination initiale, des niveaux élevés d’immunoglobulines M et G ont été observés dans les échantillons de patients. Environ six mois après la vaccination, des taux significativement plus faibles des deux anticorps étaient présents dans les échantillons de patients, mais les taux d’immunoglobuline M avaient chuté presque complètement. 18 mois après la vaccination, les anticorps anti-immunoglobuline M n’ont pas été détectés dans les échantillons de patients.
Les taux d’immunoglobuline G ont persisté et sont restés comme ceux détectés au point de six mois suivant la diminution initiale du point de temps de deux semaines.
