Pour commencer, utilisez une mandoline pour couper les pommes McIntosh en tranches de huit millimètres d’épaisseur. Coupez le tissu hypanthium des tranches de pomme en carrés de cinq millimètres sur cinq. Placez les échantillons carrés dans 0,1 % SDS pendant deux jours pour les décellulariser.
Après l’incubation, lavez les échantillons avec de l’eau déminéralisée et incubez-les pendant la nuit dans du chlorure de calcium à 100 millimolaires à température ambiante. Stérilisez ensuite ces échafaudages dans de l’éthanol à 70% pendant 30 minutes. Lavez-les avec de l’eau déminéralisée et placez-les dans une plaque de culture à 24 puits.
Pour l’ensemencement cellulaire, utilisez le sous-clone MC3T3-E1 4 cellules maintenues dans des boîtes traitées à la culture cellulaire de 10 centimètres de diamètre dans des conditions de culture cellulaire. Préparez également un milieu de culture cellulaire composé d’alpha MEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal ou FBS et 1 % de pénicilline dans la streptomycine. Une fois que les cellules atteignent 80% de confluence, détachez-les des boîtes de culture par trypsinisation.
Centrifugez la suspension cellulaire à 200g pendant trois minutes. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans l’alpha MEM. Ensuite, pipetez une aliquote de 40 microlitres de la suspension cellulaire à la surface des échafaudages et laissez les cellules adhérer pendant une heure dans des conditions de culture cellulaire.
Par la suite, ajoutez deux millilitres de milieu de culture à chaque puits de culture. Réapprovisionnez le milieu de culture tous les deux à trois jours pendant 14 jours. Après 14 jours, préparez le milieu de différenciation en ajoutant 50 microgrammes par millilitre d’acide ascorbique et quatre millimolaires de phosphate de sodium au milieu de culture cellulaire.
Ajoutez ce milieu à la plaque de culture. Incuber les échafaudages pendant quatre semaines pour induire la différenciation des cellules MC3T3-E1, et reconstituer le milieu tous les trois à quatre jours.
