Pour commencer, lavez les échafaudages de pommes décellularisés avec une solution saline tamponnée au phosphate. Pour les mesures de la taille des pores, incuber les échafaudages dans un millilitre de solution blanche de calcofluor à 10 % pendant 25 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Après avoir lavé les échafaudages avec du PBS, utilisez un microscope confocal confocal à balayage laser résonant à grande vitesse et réglez la configuration du filtre d’émission laser.
Ajustez manuellement la puissance du laser et le détecteur pour assurer une acquisition d’image optimale. Acquérez une pile Z de 20 images avec une taille de pas de cinq micromètres. Ensuite, dans le logiciel ImageJ, utilisez la fonction Z de projet à intensité maximale pour créer une image et appliquez la fonction de recherche de bords pour mettre en évidence le bord des pores.
Tracez les pores manuellement à l’aide de l’outil de sélection à main levée. Ajustez chaque pore comme une ellipse et mesurez la longueur du grand axe. Compilez toutes les mesures et calculez la longueur moyenne.
Pour l’analyse de la distribution cellulaire, après avoir lavé trois fois les échafaudages ensemencés en cellules cultivés dans le milieu approprié avec du PBS, fixez-les avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes. Ensuite, lavez soigneusement chaque échafaudage avec de l’eau déminéralisée, perméabilisez les cellules avec une solution Triton X-100 pendant cinq minutes et lavez à nouveau avec du PBS. Incubez les échafaudages dans un millilitre d’acide périodique à 1% pendant 40 minutes et rincez à l’eau déminéralisée.
Ensuite, incubez les échafaudages en les immergeant complètement dans un millilitre de solution de coloration. Lavez les échafaudages avec du PBS et colorez les noyaux cellulaires en incubant les échafaudages dans une solution DAPI de cinq milligrammes par millilitre pendant 10 minutes dans l’obscurité. Lavez à nouveau soigneusement et rangez les échafaudages dans PBS.
Imagez les échafaudages ensemencés de cellules avec un microscope confocal à balayage laser confocal résonant à grande vitesse à un grossissement de 10X en utilisant les paramètres indiqués ici. Ajustez manuellement la puissance du laser et le détecteur pour assurer une acquisition d’image optimale et acquérez une pile Z de 20 images avec une taille de pas de cinq micromètres. Utilisez ensuite le logiciel ImageJ pour traiter les images confocaux et utilisez la fonction de projection Z à l’intensité maximale pour créer une projection maximale sur l’axe z pour l’analyse d’image.
La quantification des images de microscopie confocale a démontré une distribution de la taille des pores comprise entre 73 et 288 micromètres avec une moyenne d’environ 154 micromètres. La majorité des pores variaient entre 100 et 200 micromètres. Après culture dans le milieu de différenciation, des dépôts minéraux ont été observés dans les échafaudages.
Les échafaudages ensemencés de cellules présentaient une coloration blanche opaque suggérant une minéralisation, ce qui n’a pas été observé dans les échafaudages vierges. De plus, l’analyse par microscopie confocale à balayage laser a révélé une distribution cellulaire homogène à l’intérieur des échafaudages.
