Pour les dosages de phosphatase alcaline et de dépôt de calcium, commencez par laver trois fois avec du PBS les échafaudages de pommes dérivées de graines cellulaires cultivées dans le milieu approprié. Fixez les échafaudages avec du formol tamponné neutre à 10 % pendant 30 minutes. Pour le dosage de la phosphatase alcaline, préparer la solution de coloration BCIP/NBT en dissolvant un comprimé de BCIP/NBT dans 10 millilitres d’eau déminéralisée.
Ensuite, lavez les échafaudages fixes avec une solution TWEEN à 0,05 % et teignez-les avec la solution BCIP/NBT pendant 20 minutes à température ambiante. Lavez les échafaudages de teinture avec une solution TWEEN à 0,05 % et rangez-les dans du PBS. Ensuite, imagez les échafaudages tachés avec un appareil photo numérique de 12 mégapixels.
Pour le dosage du dépôt de calcium, préparer une solution de coloration d’alizarine rouge S à 2 % en poids par volume. Ensuite, lavez les échafaudages fixes avec de l’eau déminéralisée et teignez-les avec la solution Alizarin Red S pendant une heure à température ambiante. Lavez les échafaudages tachés avec de l’eau déminéralisée et rangez-les dans du PBS avant l’imagerie.
Image avec un appareil photo numérique de 12 mégapixels. Pour effectuer les mesures de module de Young, retirez les échafaudages ensemencés de cellules de leur milieu d’incubation respectif et testez immédiatement les échantillons à l’aide d’un appareil de compression uniaxial construit sur mesure équipé d’un capteur de pesage de 1,5 newton. Comprimer les échafaudages à une vitesse constante de trois millimètres par minute jusqu’à une contrainte de compression maximale de 10 % de la hauteur de l’échafaudage.
Déterminer le module de Young à partir de la pente de la partie linéaire des courbes de contrainte/déformation. La coloration BCIP/NBT a révélé une augmentation substantielle de l’activité de la phosphatase alcaline dans les échafaudages ensemencés en cellules cultivés dans le milieu de différenciation par rapport aux échafaudages en milieu de culture vierge ou non différencié. Des résultats similaires ont été obtenus pour la coloration au rouge d’alizarine S, indiquant une plus grande minéralisation calcique dans les échafaudages à graines cellulaires cultivés dans le milieu de différenciation.
Le module de Young des échafaudages à graines cellulaires cultivés en milieu de différenciation était d’environ 192,0 kilopascal, ce qui était significativement plus élevé que les échafaudages à graines cellulaires vierges ou en milieu non différencié, ce qui indique une rigidité plus élevée.
