Pour commencer, prenez les vésicules sous-mitochondriales de levure préparées et centrifugez les vésicules générées et les mitochondries restantes intactes à 20 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Les mitochondries intactes ont formé la pastille tandis que les vésicules restent dans le surnageant. Ensuite, transférez le surnageant dans des tubes d’ultra-centrifugation frais.
Chargez un coussin de 0,3 millilitre de solution de saccharose à 2,5 molaires au fond du tube à l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une canule et d’une centrifugeuse à 118 000 G pendant 100 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, les vésicules apparaîtront sous la forme d’un disque sur le dessus du coussin de saccharose. Jeter environ 90 % du surnageant.
Pour récolter les vésicules concentrées, les remettre en suspension dans le tampon restant, y compris le saccharose à 2,5 molaires par pipetage. Transférez la suspension dans un homogénéisateur Dounce glacé et homogénéisez la suspension à l’aide d’un potier en polytétrafluoroéthylène avec au moins 10 coups. Ensuite, préparez un gradient progressif de 11 millilitres, chaque couche contenant 2,2 millilitres de solution de saccharose.
Calculez la concentration de saccharose à l’aide de cette formule. Ajoutez la concentration de saccharose la plus élevée dans le tube de centrifugation et placez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que la couche soit complètement gelée. Mesurer la concentration en saccharose des échantillons à l’aide d’un réfractomètre.
Si un réfractomètre n’est pas disponible, supposons que la concentration de saccharose est de 2 molaires. Pour ajuster la concentration de saccharose à 0,6 molaire, ajoutez le cocktail approprié d’inhibiteurs de la MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F et de la protéase à un pH de 7,4. Chargez soigneusement les échantillons sur le gradient de saccharose pour éviter de perturber le gradient.
Centrifuger les vésicules à 200 000 g et quatre degrés Celsius pendant 12 heures. Si possible, réglez une accélération et une décélération lentes pour éviter de perturber la pente. Récoltez ensuite le gradient de haut en bas par fractions de 700 microlitres, à l’aide d’une pipette d’un millilitre.
Il en résulte 17 fractions, ce qui fournit une résolution suffisante. Ensuite, effectuez deux précipitations séquentielles d’acide trichloracétique en ajoutant 200 microlitres d’acide trichloracétique à 72% aux fractions individuelles et en mélangeant jusqu’à ce que la solution soit homogène. Incuber les fractions pendant 30 minutes sur de la glace et pelleter les protéines précipitées en centrifugeant à 20 000 g et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Jeter le surnageant. Ajouter 500 microlitres de solution d’acide trichloracétique à 28%. Mélangez bien et répétez l’étape de centrifugation.
Enfin, analysez les fractions par SDS-PAGE et immunoblotting. L’importance d’une sonication douce est présentée ici. Le marqueur de la membrane externe mitochondriale Tom40 a été enrichi dans les premières fractions de faible densité et était pratiquement absent dans les plus récentes.
Le marqueur de la membrane interne mitochondriale Tim17 a été concentré dans des fractions de haute densité. En revanche, la protéine du site de contact Mic60 a accumulé des infractions de concentration intermédiaire de saccharose, indiquant la génération réussie et la séparation ultérieure des différentes vésicules membranaires. En revanche, dans des conditions de sonication plus difficiles, le marqueur de membrane externe mitochondriale Tom40 a pu être détecté dans des fractions inférieures du gradient.
De plus, il y a eu un nombre important d’infractions de densité intermédiaire de Tim17.
