M.E.H. remercie la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projet numéro 413985647, pour son soutien financier. Les auteurs remercient le Dr Michael Kiebler, de l’Université Ludwig-Maximilians de Munich, pour son soutien généreux et étendu. Nous sommes reconnaissants à Walter Neupert pour sa contribution scientifique, ses discussions utiles et son inspiration continue. J.F. remercie la Graduate School Life Science Munich (LSM) pour son soutien.

1. Tampons et solutions mères
<ol><li>Préparez une solution d’acide 3-morpholinopropane-1-sulfonique (MOPS) de 1 M dans de l’eau déminéralisée, pH 7,4. Conserver à 4 °C.</li>
	<li>Préparer 500 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans de l’eau déminéralisée, pH 8,0. Conserver à température ambiante.</li>
	<li>Préparez 2,4 M de sorbitol dans de l’eau déminéralisée. Conserver à température ambiante après l’autoclavage.</li>
	<li>Préparer 2,5 M de saccharose dans de l’eau déminéralisée. Conserver à température ambiante après l’autoclavage.</li>
	<li>Préparer 200 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) dans de l’isopropanol. Conserver à −20 °C. ATTENTION : Le PMSF est toxique en cas d’ingestion et provoque de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Ne respirez pas la poussière et portez des gants et des lunettes de protection.</li>
	<li>Préparez de l’acide trichloracétique (TCA) à 72 % dans de l’eau déminéralisée. Conserver à 4 °C. ATTENTION : Le TCA peut provoquer une irritation des voies respiratoires, de graves brûlures de la peau et des lésions oculaires. Ne respirez pas la poussière et portez des gants et des lunettes de protection.</li>
	<li>Préparer le tampon SM : 20 mM MOPS et 0,6 M de sorbitol, pH 7,4.</li>
	<li>Préparez le tampon gonflant : 20 mM de MOPS, 0,5 mM d’EDTA, 1 mM de PMSF et un cocktail d’inhibiteurs de protéase, pH 7,4.</li>
	<li>Préparez les tampons de gradient de saccharose : 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M et 1,3 M de saccharose dans 20 mM de MOPS, et 0,5 mM d’EDTA, pH 7,4. REMARQUE : Tous les tampons peuvent être stockés à 4 °C ; cependant, il est recommandé de stocker les tampons contenant du saccharose à −20 °C pour éviter la croissance fongique. Les inhibiteurs de protéase doivent être ajoutés fraîchement avant utilisation.</li>
</ol>2. Génération de vésicules soumissionnochondriales
<ol><li>Isolez les mitochondries de levure brutes fraîchement selon les protocoles établis34,35. NOTE : Pour cette expérience, des mitochondries ont été isolées de Saccharomyces cerevisiae. La génération de mitochondries pures à gradient dépourvues d’autres organites n’est pas nécessaire.</li>
	<li>Remettre en suspension 10 mg de mitochondries fraîchement isolées dans 1,6 mL de tampon SM (4 °C) par pipetage (Figure 2, étape 1).</li>
	<li>Transvaser la suspension mitochondriale dans un erlenmeyer pré-refroidi de 100 ml.</li>
	<li>Ajouter lentement 16 mL de tampon gonflant à l’aide d’une pipette en verre de 20 mL. Appliquez en remuant doucement et constamment sur la glace pendant l’ajout. Ce traitement osmotique entraîne l’absorption d’eau dans l’espace matriciel. Le gonflement de la membrane interne mitochondriale va perturber la membrane externe. Cependant, les deux membranes resteront en contact aux sites de contact9 (Figure 2, étape 2).</li>
	<li>Incuber les échantillons en remuant doucement et constamment pendant 30 minutes sur de la glace.</li>
	<li>Ajouter lentement 5 mL de solution de saccharose à 2,5 M à l’aide d’une pipette en verre de 5 mL pour augmenter la concentration de saccharose dans les échantillons à environ 0,55 M. Ce traitement osmotique se traduit par un efflux d’eau de la matrice36. Le retrait de la membrane interne est destiné à maximiser sa distance par rapport aux fragments résiduels de la membrane externe. Cela diminue la probabilité de générer des vésicules hybrides artificielles de membranes internes et externes par sonication (Figure 2, étape 3).</li>
	<li>Incuber les échantillons en remuant doucement pendant 15 min sur de la glace.</li>
	<li>Soumettre les mitochondries à une sonication pour générer des vésicules membranaires soumisesochondriales (Figure 2, étape 4).<ol><li>Transférez la suspension mitochondriale dans une cellule de rosette pré-refroidie.</li>
		<li>Soniser la suspension mitochondriale à une amplitude de 10 % pendant 30 s tout en refroidissant la cellule de la rosette dans un bain de glace.</li>
		<li>Reposer la suspension pendant 30 s dans un bain de glace.</li>
		<li>Répétez les étapes 2.8.2 et 2.8.3 trois fois de plus. REMARQUE : Les conditions de sonication varient en fonction du sonicateur utilisé. L’optimisation sera nécessaire pour les machines individuelles. Une sonication trop dure conduira à la formation artificielle de vésicules constituées de membranes internes et externes mitochondriales.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Séparation des vésicules soumissionnochondriales
<ol><li>Séparez les vésicules générées des mitochondries intactes restantes par centrifugation à 20 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Les mitochondries intactes se granuleront tandis que les vésicules resteront dans le surnageant.</li>
	<li>Concentrez le mélange de vésicules.<ol><li>Transférez le surnageant dans des tubes d’ultracentrifugation neufs.</li>
		<li>Charger un coussin de 0,3 mL de solution de saccharose 2,5 M au fond du tube à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une canule de 0,8 mm x 120 mm.</li>
		<li>Centrifuger à 118 000 x g pendant 100 min à 4 °C. REMARQUE : Ici, un rotor à godets oscillants d’un rayon maximal de 153,1 mm a été utilisé. Les conditions de centrifugation dépendent fortement du rotor et devront être adaptées lors de l’utilisation d’un autre rotor.</li>
	</ol></li>
	<li>Les vésicules apparaîtront sous la forme d’un disque sur le dessus du coussin de saccharose après la centrifugation. Jeter environ 90 % du surnageant. Maintenant, récoltez les vésicules concentrées en les remettant en suspension dans le tampon restant, y compris le saccharose de 2,5 M en pipetant de haut en bas. Transférez la suspension dans un homogénéisateur Dounce glacé.</li>
	<li>Homogénéiser la suspension avec au moins 10 coups à l’aide d’un potier en polytétrafluoroéthylène.</li>
	<li>Préparez le dégradé de saccharose.<ol><li>Pour un gradient de pas de 11 mL avec cinq étapes (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M et 0,8 M de saccharose dans 20 mM MOPS et 0,5 mM EDTA, pH 7,4), chaque couche contient 2,2 mL de solution de saccharose. REMARQUE : Un réfractomètre est recommandé pour mesurer et ajuster les concentrations de saccharose ; Cependant, ce n’est pas indispensable. Appliquez 10 μL du tampon sur le réfractomètre et détectez les indices de réfraction respectifs. Le calcul de la concentration en saccharose est le suivant : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> 1,3333 représente l’indice de réfraction de l’eau. 0,048403 est un indice de conversion spécifique du saccharose obtenu à partir de la mise à l’échelle linéaire de la réfraction molaire à la concentration de saccharose dans des solutions aqueuses 37.</li>
		<li>Ajoutez la concentration de saccharose la plus élevée dans le tube de centrifugation et placez le tube à −20 °C. Attendez que la couche soit complètement gelée avant d’appliquer la suivante. Procédez ainsi jusqu’à ce que la dernière couche soit ajoutée et stockez les dégradés à −20 °C. REMARQUE : N’oubliez pas de transférer les gradients gelés à 4 °C au début de l’expérience pour permettre aux gradients de dégeler. Cela prendra environ 3 h. Pour la centrifugation, un rotor à godets oscillants d’une capacité de 13,2 ml a été utilisé. Lorsqu’un rotor différent est utilisé, les volumes de pas de gradient doivent être adaptés en conséquence.</li>
	</ol></li>
	<li>Mesurer la concentration en saccharose des échantillons à l’aide d’un réfractomètre. S’il n’y a pas d’accès à un réfractomètre, on peut également supposer que la concentration de saccharose est de 2 M. Cette concentration supposée de saccharose servira ensuite de base à l’étape suivante.</li>
	<li>Ajustez la concentration de saccharose à 0,6 M par l’ajout d’une quantité appropriée de 20 mM de MOPS, 0,5 mM d’EDTA, 1 mM de PMSF et d’un cocktail d’inhibiteurs de protéase, pH 7,4. Si la concentration de saccharose est estimée à 2 M au lieu d’être mesurée, il est recommandé de vérifier si la concentration est suffisamment faible après ajustement. Appliquer une petite aliquote de l’échantillon (env. 50 μL) sur 200 μL de saccharose 0,8 M dans un tube à essai. L’échantillon doit rester au-dessus du saccharose de 0,8 M.</li>
	<li>Chargez les échantillons (environ 1 ml) au-dessus du gradient de saccharose (conservez 10 % pour référence ultérieure). Un pipetage minutieux est important pour éviter de perturber le gradient (Figure 2, étape 5).</li>
	<li>Séparer les vésicules par centrifugation à 200 000 x g et 4 °C pendant 12 h. Si possible, réglez la centrifugeuse sur une accélération et une décélération lentes pour éviter de perturber le gradient (Figure 2, étape 6). REMARQUE : Ici, un rotor à godets oscillants d’un rayon maximal de 153,1 mm a été utilisé. Les conditions de centrifugation dépendent fortement du rotor et devront être adaptées lors de l’utilisation d’un autre rotor.</li>
	<li>Prélever le gradient de haut en bas par fractions de 700 μL à l’aide d’une pipette de 1 mL. Cela se traduira par 17 fractions, ce qui permet une résolution suffisante.</li>
</ol>4. Analyse des vésicules soumissionnochondriales
<ol><li>Concentrer les protéines en soumettant chaque fraction à deux précipitations séquentielles de TCA38 pour préparer les échantillons SDS-PAGE.<ol><li>Ajouter 200 μL de TCA à 72 % aux fractions individuelles et mélanger jusqu’à ce que la solution soit homogène. Incuber les fractions pendant 30 min sur de la glace, et granuler les protéines précipitées par centrifugation à 20 000 x g et 4 °C pendant 20 min. Jeter le surnageant, ajouter 500 μL de solution de TCA à 28 %, bien mélanger et répéter l’étape de centrifugation.</li>
		<li>Lavez les granulés avec 1 mL d’acétone (−20 °C) et centrifugez pendant 10 min à 20 000 x g et 4 °C. Jetez le surnageant et laissez les granulés sécher à l’air libre. Remettre les pastilles en suspension dans 60 μL de tampon d’échantillon SDS et incuber les échantillons pendant 5 min à 95 °C. REMARQUE : Une grande quantité de saccharose restera, en particulier dans les fractions à haute densité, après les premières précipitations de TCA. Celle-ci sera éliminée par les précipitations supplémentaires de TCA.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyser 20 μL de chaque fraction par SDS-PAGE39 et immunoblot40,41,42,43.</li>
</ol>

Isolement des sites de contact mitochondriaux

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Le subfractionnement mitochondrial est une expérience compliquée avec plusieurs étapes très complexes. C’est pourquoi nous avons cherché à améliorer et, dans une certaine mesure, à simplifier notre méthode établie32. Ici, les défis étaient la nécessité d’équipements compliqués et hautement spécialisés, qui sont souvent des constructions individuelles, et l’énorme consommation de temps et d’énergie. À cette fin, nous avons essayé de supprimer les pompes et les construc...

Les mitochondries remplissent une variété de fonctions différentes chez les eucaryotes, la plus connue étant la production d’ATP par phosphorylation oxydative. D’autres fonctions incluent la production d’amas fer-soufre, la synthèse des lipides et, chez les eucaryotes supérieurs, la signalisation Ca2+ et l’induction de l’apoptose 1,2,3,4. Ces fonctions sont indissociablement liées à leur ultrastructure complexe.
L’ultrastructure mitochondriale a été décrite pour la première fois par microscopie électronique5. Il a été montré que les mitochondries sont des organites assez complexes constitués de deux membranes : la membrane externe mitochondriale et la membrane interne mitochondriale. Ainsi, deux compartiments aqueux sont formés par ces membranes : l’espace intermembranaire et la matrice. La membrane interne mitochondriale peut être encore plus divisée en différentes sections. La membrane limite interne reste à proximité de la membrane externe et les crêtes forment des invaginations. Ce que l’on appelle des jonctions de crêtes relient la membrane limite interne et les crêtes (Figure 1). De plus, les micrographies électroniques de mitochondries osmotiquement rétrécies révèlent qu’il existe des sites où les membranes mitochondriales sont étroitement connectées 6,7. Ces sites dits de contact sont formés par des complexes protéiques qui s’étendent sur les deux membranes (Figure 1). On pense que ces sites d’interaction sont essentiels à la viabilité cellulaire en raison de leur importance pour la régulation de la dynamique et de l’hérédité mitochondriales, ainsi que pour le transfert de métabolites et de signaux entre le cytosol et la matrice8.
Le complexe MICOS dans la membrane interne mitochondriale est probablement le complexe de formation de site de contact le mieux caractérisé et le plus polyvalent. MICOS a été décrit dans la levure en 2011 et se compose de six sous-unités 9,10,1 1 : Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 et Mic10. Ceux-ci forment un complexe d’environ 1,5 MDa qui se localise aux jonctionsde crista 9,10,11. La délétion de l’une ou l’autre des sous-unités centrales, Mic10 ou Mic60, conduit à l’absence de ce complexe 9,11, ce qui signifie que ces deux sous-unités sont essentielles à la stabilité de MICOS. Il est intéressant de noter que MICOS forme non pas un, mais plusieurs sites de contact avec diverses protéines et complexes de la membrane externe mitochondriale : le complexe TOM 11,12, le complexe TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, le complexe Fzo1-Ugo19,Por1 10, OM45 10 et Miro 17. Cela indique fortement que le complexe MICOS est impliqué dans divers processus mitochondriaux, tels que l’importation de protéines, le métabolisme des phospholipides et la génération de l’ultrastructure mitochondriale18. Cette dernière fonction est probablement la fonction majeure de MICOS, car l’absence du complexe MICOS induite par la délétion de MIC10 ou MIC60 conduit à une ultrastructure mitochondriale anormale qui est pratiquement complètement dépourvue de crêtes régulières. Au lieu de cela, les vésicules membranaires internes sans connexion à la membrane limite interne s’accumulent19, 20. Il est important de noter que MICOS est conservé dans sa forme et sa fonction de la levure à l’homme21. L’association de mutations dans les sous-unités MICOS avec des maladies humaines graves souligne également son importance pour les eucaryotes supérieurs22,23. Bien que MICOS soit très polyvalent, il doit exister d’autres sites de contact (sur la base de nos observations non publiées). En effet, plusieurs autres sites de contact ont été identifiés, par exemple, les machineries de fusion mitochondriale Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 ou encore Mdm31-Por1, qui est impliquée dans la biosynthèse du phospholipide spécifique mitochondrial, cardiolipine 27. Récemment, nous avons amélioré la méthode qui nous a conduits à l’identification de MICOS pour identifier Cqd1 dans le cadre d’un nouveau site de contact formé avec le complexe membranaire externe Por1-Om1428. Il est intéressant de noter que ce site de contact semble également être impliqué dans de multiples processus tels que l’homéostasie de la membrane mitochondriale, le métabolisme des phospholipides et la distribution de la coenzyme Q28,29.
Ici, nous avons utilisé une variante du fractionnement des mitochondries 9,30,31,32,33 décrit précédemment. Le traitement osmotique des mitochondries conduit à la perturbation de la membrane externe mitochondriale et à un rétrécissement de l’espace matriciel, ne laissant les deux membranes qu’à proximité sur les sites de contact. Cela permet de générer des vésicules qui se composent exclusivement de la membrane externe mitochondriale ou de la membrane interne mitochondriale ou des sites de contact contenus des deux membranes par sonication douce. En raison de la membrane interne mitochondriale possédant un rapport protéines/lipides beaucoup plus élevé, les vésicules de la membrane interne mitochondriale présentent une densité plus élevée que les vésicules de la membrane externe mitochondriale. La différence de densité peut être utilisée pour séparer les vésicules membranaires par centrifugation à gradient de densité flottante de saccharose. Ainsi, les vésicules de la membrane externe mitochondriale s’accumulent à de faibles concentrations de saccharose, tandis que les vésicules de la membrane interne mitochondriale sont enrichies à des concentrations élevées de saccharose. Les vésicules contenant des sites de contact se concentrent à des concentrations intermédiaires de saccharose (figure 2). Le protocole suivant décrit en détail cette méthode améliorée, qui nécessite moins d’équipement spécialisé, de temps et d’énergie par rapport à notre méthode précédemment établie32, et fournit un outil utile pour l’identification d’éventuelles protéines du site de contact.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbe refractometer</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipet Controller</td>
			<td>Brandtech, USA</td>
			<td>BR26320</td>
			<td>discontinued, 
			any pipet controller will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker 1000 mL</td>
			<td>DWK Life Science, Germany</td>
			<td>C118.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson&#160; Digital Sonifier W-250 D</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>FIS15-338-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>101-148-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell</td>
			<td>Branson Ultrasonics, USA</td>
			<td>15-338-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>B37912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>8043-30-0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbit</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>6213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>X747.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05</td>
			<td>Hirschmann, Germany</td>
			<td>1180153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bath</td>
			<td>neoLab, Germany</td>
			<td>&#160;S12651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer RCT basic</td>
			<td>IKA-Werke GmbH, Germany</td>
			<td>Z645060GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)</td>
			<td>Gerbu, Germany</td>
			<td>1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P1000</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10006S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P20</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPipetman Select P200</td>
			<td>Gilson, USA</td>
			<td>FP10005S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix 1 mL</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495251879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Serva, Germany</td>
			<td>32395.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td>
			<td>Braun, Germany</td>
			<td>4022495052414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stirring bar, 15 mm</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>442-0366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Instruments, Germany</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip</td>
			<td>VWR, USA</td>
			<td>432-0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>33731</td>
			<td>discontinued, 
			any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>4855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved method to isolate mitochondrial contact sites

Les mitochondries sont présentes dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes et remplissent des fonctions essentielles qui vont bien au-delà de la production d’énergie, par exemple, la synthèse d’amas fer-soufre, de lipides ou de protéines, le tampon Ca2+ et l’induction de l’apoptose. De même, le dysfonctionnement mitochondrial entraîne des maladies humaines graves telles que le cancer, le diabète et la neurodégénérescence. Afin de remplir ces fonctions, les mitochondries doivent communiquer avec le reste de la cellule à travers leur enveloppe, qui se compose de deux membranes. Par conséquent, ces deux membranes doivent interagir constamment. Les sites de contact protéique entre les membranes interne et externe mitochondriales sont essentiels à cet égard. Jusqu’à présent, plusieurs sites de contact ont été identifiés. Dans la méthode décrite ici, les mitochondries de Saccharomyces cerevisiae sont utilisées pour isoler les sites de contact et, ainsi, identifier les candidats qui se qualifient pour les protéines de site de contact. Nous avons utilisé cette méthode pour identifier le complexe MICOS (MICOS) qui forme le site de contact mitochondrial et le système d’organisation des crêtes, l’un des principaux complexes formant des sites de contact dans la membrane interne mitochondriale, qui est conservé de la levure à l’homme. Récemment, nous avons encore amélioré cette méthode pour identifier un nouveau site de contact composé de Cqd1 et du complexe Por1-Om14.

Mitochondria perform a variety of different functions in eukaryotes, with the most well-known being the production of ATP through oxidative phosphorylation. Other functions include the production of iron-sulfur clusters, lipid synthesis, and in higher eukaryotes, Ca2+ signaling, and the induction of apoptosis1,2,3,4. These functions are inseparably linked to their complex ultrastructure.
The mitochondrial ultrastructure was first described by electron microscopy5. It was shown that mitochondria are rather complex organelles consisting of two membranes: the mitochondrial outer membrane and the mitochondrial inner membrane. Thus, two aqueous compartments are formed by these membranes: the intermembrane space and the matrix. The mitochondrial inner membrane can be even further divided into different sections. The inner boundary membrane stays in close proximity to the outer membrane, and the cristae form invaginations. So-called crista junctions connect the inner boundary membrane and the cristae (Figure 1). Furthermore, electron micrographs of osmotically shrunken mitochondria reveal that sites exist at which the mitochondrial membranes are tightly connected6,7. These so-called contact sites are formed by protein complexes spanning the two membranes (Figure 1). It is thought that these interaction sites are essential for cell viability due to their importance for the regulation of mitochondrial dynamics and inheritance, as well as the transfer of metabolites and signals between the cytosol and the matrix8.
The MICOS complex in the mitochondrial inner membrane is probably the best characterized and the most versatile contact site-forming complex. MICOS was described in yeast in 2011, and it consists of six subunits9,10,11: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12, and Mic10. These form a complex of approximately 1.5 MDa that localizes to the crista junctions9,10,11. The deletion of either core subunit, Mic10 or Mic60, leads to the absence of this complex9,11, meaning these two subunits are essential for the stability of MICOS. Interestingly, MICOS forms not only one but multiple contact sites with various mitochondrial outer membrane proteins and complexes: the TOM complex11,12, the TOB/SAM complex9,12,13,14,15,16, the Fzo1-Ugo1 complex9, Por110, OM4510, and Miro17. This strongly indicates that the MICOS complex is involved in various mitochondrial processes, such as protein import, phospholipid metabolism, and the generation of the mitochondrial ultrastructure18. The latter function is probably the major function of&#160;MICOS, as the absence of the MICOS complex induced through the deletion of MIC10&#160;or MIC60&#160;leads to an abnormal mitochondrial ultrastructure that virtually completely lacks regular cristae. Instead, internal membrane vesicles without connection to the inner boundary membrane accumulate19, 20. Importantly, MICOS is conserved in form and function from yeast to&#160;human21. The association of mutations in MICOS subunits with severe human diseases also emphasizes its importance for higher eukaryotes22,23. Although MICOS is highly versatile, additional contact sites must exist (based on our unpublished observations). Indeed, several other contact sites have been identified, for instance, the mitochondrial fusion machineries Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26&#160;or Mdm31-Por1, which is involved in the biosynthesis of the mitochondrial-specific phospholipid cardiolipin27. Recently, we improved the method that led us to the identification of MICOS to identify Cqd1 as part of a novel contact site formed with the outer membrane complex Por1-Om1428. Interestingly, this contact site also seems to be involved in multiple processes such as mitochondrial membrane homeostasis, phospholipid metabolism, and the distribution of coenzyme Q28,29.
Here, we used a variation of the previously described fractionation of mitochondria9,30,31,32,33. Osmotic treatment of mitochondria leads to the disruption of the mitochondrial outer membrane and to a shrinkage of the matrix space, leaving the two membranes only in close proximity at contact sites. This allows for the generation of vesicles that consist exclusively of mitochondrial outer membrane or mitochondrial inner membrane or at contain contact sites of both membranes through mild sonication. Due to the mitochondrial inner membrane possessing a much higher protein-to-lipid ratio, mitochondrial inner membrane vesicles exhibit a higher density compared to mitochondrial outer membrane vesicles. The difference in density can be used to separate the membrane vesicles through sucrose buoyant density gradient centrifugation. Thus, the mitochondrial outer membrane vesicles accumulate at low sucrose concentrations, while the mitochondrial inner membrane vesicles are enriched at high sucrose concentrations. The vesicles containing contact sites concentrate at intermediate sucrose concentrations (Figure 2). The following protocol describes this improved method, which requires less specialized equipment, time, and energy compared to our previously established one32, in detail and provides a useful tool for the identification of possible contact site proteins.

Pleins feux sur l’auteur : Dévoilement des sites de contact mitochondriaux et des aperçus architecturaux 

Une méthode améliorée pour isoler les sites de contact mitochondrial

We aim to understand the molecular function of mitochondrial contact sites, allowing the communication between the two mitochondrial membranes. This actually is a prerequisite to grasp the function for mitochondrial biogenesis and thus, cell viability. We discovered a new contact site between the mitochondrial inner and outer membrane created by Cqd1 and Om14-Por1.Our data suggests that this site might assist in lipid import like phosphatidic acid. Based on the identification of the MICOS complex, we contributed to get a deeper understanding of how mitochondrial membrane architecture is generated. This allowed us to develop a working model that explains how the two forms of mitochondrial cristae, lamellar and tubular cristae are formed.Our research was done in yeast in the past. However, we are convinced that the formation of correct mitochondrial architecture is important for higher eukaryotes too. So the next step in our research is analyzing the role of mitochondrial architecture elements in more complex models such as primary neurons.

Il est relativement facile de séparer les membranes internes et externes des mitochondries. Cependant, la génération et la séparation des vésicules contenant le site de contact sont beaucoup plus difficiles. À notre avis, deux étapes sont critiques et essentielles : les conditions de sonication et le gradient utilisé.
Habituellement, on pense que les dégradés linéaires ont une meilleure résolution que les dégradés par étapes. Cependant, leur production reproductible est fastidie...

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Les sites de contact mitochondrial sont des complexes protéiques qui interagissent avec les protéines membranaires internes et externes mitochondriales. Ces sites sont essentiels pour la communication entre les membranes mitochondriales et, par conséquent, entre le cytosol et la matrice mitochondriale. Nous décrivons ici une méthode permettant d’identifier les candidats éligibles à cette classe spécifique de protéines.

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Nous visons à comprendre la fonction moléculaire des sites de contact mitochondriaux, permettant la communication entre les deux membranes mitochondriales. Il s’agit en fait d’une condition préalable à la compréhension de la fonction de la biogenèse mitochondriale et, par conséquent, de la viabilité cellulaire. Nous avons découvert un nouveau site de contact entre la membrane interne et externe mitochondriale créé par Cqd1 et Om14-Por1.Nos données suggèrent que ce site pourrait aider à l’importation de lipides comme l’acide phosphatidique. Sur la base de l’identification du complexe MICOS, nous avons contribué à mieux comprendre comment l’architecture de la membrane mitochondriale est générée. Cela nous a permis de développer un modèle de travail qui explique comment se forment les deux formes de crêtes mitochondriales, lamellaires et tubulaires.Nos recherches ont été effectuées sur la levure dans le passé. Cependant, nous sommes convaincus que la formation d’une architecture mitochondriale correcte est également importante pour les eucaryotes supérieurs. La prochaine étape de notre recherche consiste donc à analyser le rôle des éléments de l’architecture mitochondriale dans des modèles plus complexes tels que les neurones primaires.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

1.0K vues.  Ludwig-Maximilians University Munich. Nous visons à comprendre la fonction moléculaire des sites de contact mitochondriaux, permettant la communication entre les deux membranes mitochondriales. Il s’agit en fait d’une condition préalable à la compréhension de la fonction de la biogenèse mitochondriale et, par conséquent, de la viabilité cellulaire. Nous avons découvert un nouveau site de contact entre la membrane interne et externe mitochondriale créé par Cqd1 et Om14-Por1.Nos données suggèrent que ce site...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Dévoilement des sites de contact mitochondriaux et des aperçus architecturaux 

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Recherche

Biochimie

Generating Submitochondrial Vesicles from Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Generating Submitochondrial Vesicles from  Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites  

To begin, take 10 milligrams of freshly-isolated crude yeast mitochondria and re-suspend them in 1.6 milliliters of SM buffer at four degrees celsius by pipetting. Then, transfer the mitochondrial suspension to a pre-cooled 100-milliliter Erlenmeyer flask. Slowly, add 16 milliliters of the swelling buffer, using a 20-milliliter glass pipette while applying constant mild stirring on ice.Incubate the samples under constant mild stirring for 30 minutes on ice. Then, slowly add five milliliters of 2.5-molar sucrose solution using a five-milliliter glass pipette, allowing the inner membrane to shrink. Incubate the samples under mild stirring for 15 minutes on ice.To generate sub-mitochondrial membrane vesicles, transfer the mitochondrial suspension to a pre-cool rosette cell, and sonicate the suspension at 10%amplitude for 30 seconds while cooling the rosette cell in an ice bath. Rest the suspension for 30 seconds in an ice bath.

Génération de vésicules soumochondriales à partir de mitochondries de Saccharomyces cerevisiae pour isoler les sites de contact mitochondriaux

Separation and Analysis of Submitochondrial Vesicles to Identify Mitochondrial Contact Site Proteins

To begin, take the prepared yeast sub-mitochondrial vesicles and centrifuge the generated vesicles and remaining intact mitochondria at 20, 000 G for 20 minutes at four degrees Celsius. The intact mitochondria formed the pellet while the vesicles stay in the supernatant. Next, transfer the supernatant to fresh ultra centrifugation tubes.Load a cushion of 0.3 milliliters of 2.5 molar sucrose solution at the bottom of the tube using a one milliliter syringe equipped with a cannula, and centrifuge at 118, 000 G for 100 minutes at four degrees Celsius. After centrifugation, the vesicles will appear as a disc on the top of the sucrose cushion. Discard approximately 90%of the supernatant.To harvest the concentrated vesicles, resuspend them in the remaining buffer, including the 2.5 molar sucrose by pipetting. Transfer the suspension to an ice cold Dounce homogenizer and homogenize the suspension using a polytetrafluoroethylene potter with at least 10 strokes. Next, prepare an 11 milliliter step gradient with each layer containing 2.2 milliliters of sucrose solution.Calculate the sucrose concentration using this formula. Add the highest sucrose concentration to the centrifugation tube and place it at minus 20 degrees Celsius until the layer is completely frozen. Measure the sucrose concentration of the samples using a refractometer.If a refractometer is unavailable, assume the sucrose concentration is 2 molar. To adjust the sucrose concentration to 0.6 molars, add the appropriate MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F, and protease inhibitor cocktail at pH 7.4. Carefully load the samples on the sucrose gradient to avoid the disturbance of the gradient.Centrifuge the vesicles at 200, 000 G and four degree Celsius for 12 hours. If possible, set slow acceleration and deceleration to avoid disruption of the gradient. Then harvest the gradient from top to bottom in 700 microliters fractions, using a one milliliter pipette.Resulting in 17 fractions, which provides a sufficient resolution. Next, perform two sequentially executed trichloroacetic acid precipitations by adding 200 microliters of 72%trichloroacetic acid to the individual fractions and mixing until the solution is homogeneous. Incubate the fractions for 30 minutes on ice and pellet the precipitated proteins by centrifuging at 20, 000 G and four degrees Celsius for 20 minutes.Discard the supernatant. Add 500 microliters of 28%trichloroacetic acid solution. Mix well and repeat the centrifugation step.Finally, analyze the fractions by SDS-PAGE and immunoblotting. The importance of mild sonication is presented here. The mitochondrial outer membrane marker Tom40 was enriched in the early low density fractions and was virtually absent in the later ones.The mitochondrial inner membrane marker Tim17 was concentrated in high density fractions. In contrast, the contact site protein Mic60 accumulated infractions of intermediate sucrose concentration, indicating the successful generation and subsequent separation of the various membrane vesicles. In contrast, with harsher sonication conditions, the mitochondrial outer membrane marker Tom40 could be detected in lower fractions of the gradient.Additionally, there was a significant amount of Tim17 infractions of intermediate density.