Commencez par placer les carcasses de larves de drosophiles marquées par des anticorps dans un PBST à 0,2 % sur une lame de verre. Ajusté au microscope stéréoscopique, en veillant à ce que la surface interne de la carcasse larvaire soit orientée vers le haut. Absorbez l’excès de solution PBST à l’aide d’une lingette.
Ajoutez ensuite délicatement une goutte de médium de montage Anti-Fade. Ensuite, placez une lamelle de couverture sur la lame recouvrant les larves disséquées lentement et doucement, en évitant la formation de bulles. Fixez le couvercle en place en appliquant du vernis à ongles sur ses bords.
Rangez la lame dans un endroit sombre pour minimiser l’atténuation des fluorescents. Pour l’acquisition d’images, utilisez le microscope confocal à balayage laser avec l’objectif à immersion dans l’huile 63x. Ajustez ensuite la longueur d’onde et la puissance du laser pour répondre au mieux aux exigences de l’expérience.
Pour identifier les jonctions neuromusculaires et capturer des images du muscle quatre dans le segment A trois, sélectionnez un laser de 488 nanomètres pour activer l’alpha tubuline ou Futsch, et de 546 nanomètres pour activer la piste d’imagerie HRP. Modifiez les paramètres pour obtenir une taille d’image de 1 024 x 1 024 pixels, un zoom numérique de 1,0 et un intervalle d’imagerie de 0,8 micromètre. Pour visualiser les microtubules dans le muscle, capturez des images du muscle deux dans les segments A trois à A cinq, car il a moins de branches trachéales.
Choisissez un laser de 488 nanomètres pour activer l’alpha-tubuline et un laser de 633 nanomètres pour activer la piste d’imagerie T3605. Ajustez les paramètres d’imagerie à une taille d’image de 1 024 x 1 024 pixels, à un zoom numérique de 2,0 et à un intervalle d’imagerie de 0,4 micromètre. Les organisations des microtubules pré et post-synaptiques de la jonction neuromusculaire ont été marquées avec de la tubuline anti-alpha.
La coloration de Futsch a reflété l’abondance de microtubules stables dans les neurones pré-synaptiques. Une diminution de l’intensité du signal de l’anti-Futsch a été observée lorsque les microtubules sectionnant la protéine Katanin 60 étaient surexprimés dans les neurones présynaptiques. L’intensité de coloration du tronc axonale était plus forte que celle des branches.
Les mutations de Katanin 60 ont entraîné une augmentation des boucles de microtubules. La surexpression de Katanin 60 a provoqué de courts fragments de microtubules à l’intérieur des boutons terminaux. La coloration à l’alpha-tubuline a mis en évidence un réseau clair de microtubules autour du noyau.
Les cellules musculaires présentaient une intensité microtubulaire périnucléaire significativement accrue et présentaient des faisceaux plus forts chez le mutant Katanin 60. La surexpression a entraîné une fragmentation des fibres des microtubules.
