Pour commencer, placez l’appareil micro sim assemblé dans des colliers de serrage stériles. Cultivez le dispositif dans une grande boîte de Pétri stérile. Pour plus d’humidité, placez un couvercle tubulaire conique de 50 millilitres rempli d’eau stérile.
Pour préparer l’appareil à la culture cellulaire, rincez la chambre supérieure avec 100 microlitres d’eau. Ensuite, préparez une solution d’enrobage en mélangeant du collagène quatre, de la fibronectine bovine et de l’eau stérile. Retirez l’eau de la chambre supérieure et ajoutez 100 microlitres de solution de revêtement.
Incuber la chambre à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures. Après l’incubation, remplacez la solution d’enrobage dans la chambre supérieure par 100 microlitres d’HECSR à température ambiante. Ajouter 20 microlitres de solution HECSR dans la chambre inférieure.
Pour faire passer les cellules de type EECM-BMEC, ajoutez un mélange d’enzymes de détachement cellulaire aux cellules et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq à huit minutes. Ensuite, pipetez la suspension cellulaire et ajoutez-la à quatre fois le volume du milieu endothélial dans un tube à centrifuger. Centrifugez à 200G pendant cinq minutes et remettez les cellules en suspension dans un millilitre d’HECSR.
Ensemencez les cellules à une densité de 40 000 cellules par centimètre carré dans la chambre supérieure et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures pour faciliter l’adhésion des cellules. Après l’incubation, remplacez le milieu par de l’HECSR frais dans les deux chambres. Fixez les cellules en ajoutant 20 microlitres de méthanol à 100 %, refroidis à moins 20 degrés Celsius dans la chambre inférieure et 50 microlitres dans la chambre supérieure.
Incubez l’appareil à température ambiante pendant deux à 10 minutes. Ensuite, lavez les cellules en ajoutant 20 microlitres de PBS dans la chambre inférieure et 100 microlitres dans la chambre supérieure. Après chaque lavage, vérifiez l’absence de bulles dans la chambre inférieure.
Bloquez les cellules pendant 30 minutes en ajoutant 20 microlitres de solution de blocage dans la chambre inférieure et 50 microlitres dans la chambre supérieure. Après le blocage, remplacez le volume dans la chambre supérieure par 50 microlitres de la solution d’anticorps primaire et incubez pendant une heure à température ambiante. Après le lavage PBS, ajoutez 50 microlitres de la solution d’anticorps secondaire dans la chambre supérieure et incubez pendant une heure à l’abri de la lumière.
Après le lavage PBS, ajoutez 50 microlitres de Hoechst dans la chambre supérieure et incubez pendant trois minutes. Ajoutez ensuite 20 microlitres de PBS dans la chambre inférieure et 100 microlitres dans la chambre supérieure. Imagez immédiatement l’appareil sur un microscope confocal.
Localisez la fenêtre à membrane à l’aide d’un objectif humide à longue distance de travail 40x et passez aux canaux de fluorescence pour vérifier la coloration de Hoechst et de jonction. Les densités de siège optimales pour la culture cellulaire HIPSC et le BPLC sous-ensemencé sont démontrées ici. La co-culture dérivée du HIPSC était plus facile à distinguer en imagerie par contraste de phase que les co-cultures primaires.
Un faible ensemencement BPLC entraîne une mauvaise couverture parasitaire et l’agglutination, tandis qu’une suralimentation entraîne le décollement de la couche parasitaire de la membrane. Dans la co-culture de cellules dérivées de HIPSC immunocolorées, deux couches de cellules ont été observées à proximité l’une de l’autre, séparées uniquement par une fine nanomembrane de nitrure de silicium. Dans le test de perméabilité, une grande variabilité de la perméabilité des cellules endothéliales cultivées pendant deux jours indique que deux jours de culture étaient insuffisants pour la maturation de la barrière.
De plus, il n’y avait pas de différences significatives de perméabilité entre les laboratoires lors de la maturation de la barrière à partir de quatre jours.
