Pour commencer, après avoir acquis le long ARN non codant d’intérêt, incuber le tampon d’hybridation à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, dissoudre la sonde à quatre densités optiques dans 160 microlitres d’eau déminéralisée traitée au pyrocarbonate diéthylique à l’abri de la lumière. Préparez 200 microlitres du mélange de sonde pour chaque puits et mettez en place une série de 50, 25, 12,5 et six microgrammes par millilitre.
Dénaturer le mélange de sondes à 73 degrés Celsius pendant cinq minutes. Prenez une plaque de culture cellulaire à 12 puits contenant des cellules 143B sur des lamelles de verre stériles. Retirez le support et lavez deux fois pendant cinq minutes avec du PBS.
Placez les cellules sur un shaker. Retirez ensuite le PBS et ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 100 % dans chaque puits, en fixant pendant 15 minutes à température ambiante. Retirez ensuite l’éthanol, ajoutez 200 microlitres de 0,1 % de Triton X-100 dans chaque puits et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.
Retirez 0,1 % de Triton X-100 et lavez deux fois pendant cinq minutes avec du PBS. Ensuite, retirez le PBS, ajoutez 200 microlitres de citrate salin de sodium ou de tampon SSC dans chaque puits et incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez deux fois le tampon SSC, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 70 % dans chaque puits et incubez pendant trois minutes à température ambiante.
Jetez l’éthanol à 70 %, puis ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 85 % dans chaque puits et incubez pendant trois minutes à température ambiante. Ensuite, jetez l’éthanol à 85 %, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 100 % dans chaque puits et incubez pendant trois minutes à température ambiante. Ensuite, absorbez et jetez l’éthanol à 100 % et laissez les puits sécher.
Ensuite, ajoutez 200 microlitres de mélange de sonde dénaturée dans chaque puits, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, prélever des échantillons à 37 degrés Celsius, jeter le mélange de sonde et ajouter 200 microlitres de tampon préchauffé 0,4 fois SSC 0,3 % entre 20 dans chaque puits et laver pendant deux minutes à température ambiante. Retirez la mémoire tampon de 0,4 fois SSC 0,3 % entre 20.
Ajouter 200 microlitres de tampon deux fois SSC 0,1 % Tween 20 dans chaque puits et laver pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, supprimez le tampon SSC 0,1 % entre 20 fois les deux fois. Ajouter 200 microlitres de solution colorante DAPI et colorer pendant 20 minutes dans l’obscurité sur un shaker.
Après la coloration, jetez la solution DAPI et lavez-la avec du PBS pendant deux minutes à température ambiante. Enfin, ajoutez 50 microlitres de milieu de montage contenant de la gomme à la lame et placez la lamelle de verre pour fixer la lame. Des images représentatives de SNHG6 FISH dans des cellules d’ostéosarcome humain sont présentées.
La sonde SNHG6 marquée avec Cy3, qui émet une fluorescence rouge, a montré que SNHG6 est principalement localisé dans le cytoplasme. Une couleur de fond a été observée lors de l’utilisation d’une forte concentration de sonde.
