Ces travaux sont soutenus par des subventions de (1) le Programme national de recherche et développement clés de la Chine (2020YFE0201600) ; (2) la National Nature Science Foundation (81973877 et 82174408) ; (3) Centre d’innovation collaborative de Shanghai pour la transformation industrielle de la préparation de la MTC hospitalière ; (4) Projets de recherche dans le cadre du budget de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (2021LK047).

Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole. La figure 1 montre le protocole global pour l’ARN FISH ; Le tableau 1 contient la composition de toutes les solutions et le tableau 2 contient les séquences d’amorces utilisées dans ce protocole.
1. Préparation de la sonde
<ol><li>Identifier et acquérir la séquence FASTA d’un ARNlnc cible d’intérêt, par exemple, à partir de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). En suivant les indications sur le site Web, concevez les sondes ISH en ligne19 et passez en revue les suggestions de l’algorithme de conception pour répertorier les sondes à commander avec l’étiquette Cy3.</li>
	<li>Incuber le tampon d’hybridation à 37 °C pendant 2 h à l’avance.</li>
	<li>Dissoudre la sonde à 4 densités optiques (OD) dans 160 μL de ddH2O traité au diéthylpyrocarbonate (DEPC) à la concentration de 1 mg/mL à l’abri de la lumière. REMARQUE : La densité optique (OD) représente l’unité de mesure de l’ADN et de l’ARN. Habituellement, 1 unité OD = 33 μg/mL d’ADN.</li>
	<li>Préparer 200 μL du mélange de sonde pour chaque puits (1,2 μL-10 μL de sonde, 70 μL de tampon d’hybridation, compléter le volume avec du ddH2O à 200 μL traité par DEPC) et mettre en place une série de 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL et 6 μg/mL. REMARQUE : La concentration de la sonde doit être explorée expérimentalement à l’avance. Une concentration élevée de sonde conduira à une liaison non spécifique des ARNlnc, tandis qu’une faible concentration de sonde conduira à une détection insensible ou à l’échec de la détection des ARNlnc.</li>
	<li>Dénaturer le mélange de sonde à 73 °C pendant 5 min. REMARQUE : Si la sonde d’ADN marquée Cy3 est double brin, dénaturez la sonde en ADN simple brin à 95 °C pendant 5 minutes, puis refroidissez rapidement pendant 2 minutes sur de la glace.</li>
</ol>2. Préparation des cellules
<ol><li>Ensemencer 50 000 cellules 143B par puits sur des lamelles de verre stériles dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits et les incuber pendant 24 h (37 °C, 5 % CO2) dans du DMEM. REMARQUE : Le nombre spécifique de cellules ensemencées ici varie en fonction de la taille des cellules, ce qui est approprié pour que les cellules ensemencées atteignent une confluence de 50% après avoir été incubées pendant 24 h. Les lamelles en verre stériles sont rondes pour s’adapter à la plaque à 12 puits.</li>
	<li>Retirez le milieu et lavez pendant 2 x 5 min avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). REMARQUE : Préparez 1x PBS avec du ddH2O traité par DEPC. Le PBS sans traitement DEPC ne peut pas être utilisé car il contient de la RNase. Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions exemptes de RNase.</li>
	<li>Retirez 1x PBS et ajoutez 200 μL d’éthanol à 100 % dans chaque puits pour fixer pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirer l’éthanol, ajouter 200 μL de Triton X-100 à 0,1 % (dans 1 PBS) dans chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante. REMARQUE : Le temps doit être strictement contrôlé avec la perméabilisation Triton X-100 et ne doit pas être trop long.</li>
	<li>Retirez 0,1 % de Triton X-100 et lavez 2 x 5 min avec 1x PBS. REMARQUE : Si le protocole doit être interrompu ici, remplacez le PBS par de l’éthanol à 70% (dilution de l’éthanol à 100% avec du ddH2O sans RNase) et conservez l’échantillon à 4 °C jusqu’à 3 mois.</li>
	<li>Retirer 1x PBS, ajouter 200 μL de tampon 2x citrate salin de sodium (SSC) (dilution de 20x SSC avec du ddH2O sans RNase) dans chaque puits, et incuber pendant 30 min à 37 °C.</li>
	<li>Retirez 2 tampons SSC, ajoutez 200 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et incubez pendant 3 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Jeter l’éthanol à 70 %, ajouter 200 μL d’éthanol à 85 % (dilution de l’éthanol à 100 % avec du ddH2O sans RNase) dans chaque puits et incuber pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>Jetez l’éthanol à 85 %, ajoutez 200 μL d’éthanol à 100 % dans chaque puits et incubez pendant 3 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Absorber et jeter 100 % d’éthanol ; Laissez sécher les puits.</li>
</ol>3. Hybridation in situ par fluorescence (FISH)
<ol><li>Ajouter 200 μL de mélange de sondes (dénaturé comme à l’étape 1.5) dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant la nuit (16-18 h). NOTE : Il existe une forte corrélation positive entre la température d’hybridation et la concentration de la sonde ; Par conséquent, pour optimiser le bruit de fond, la température d’hybridation et la concentration de la sonde doivent être réduites.</li>
	<li>Le lendemain, prélevez des échantillons à 37 °C et jetez le mélange de sondes. Ajouter 200 μL de tampon 0,4x SSC/0,3 % Tween-20 dans chaque puits (préchauffé à 65 °C) et laver pendant 2 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez le tampon 0,4x SSC/0,3 % Tween-20, ajoutez 200 μL de tampon 2x SSC/0,1 % Tween-20 dans chaque puits et lavez pendant 2 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Retirer 2 tampons SSC/0,1 % Tween-20, ajouter 200 μL de solution colorante 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 μg/mL) et colorer pendant 20 minutes à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Jetez la solution de colorant DAPI et lavez avec 1x PBS pendant 2 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajoutez 50 μL de médium de montage contenant de la gomme sur la lame et placez la lamelle en verre sur la lame pour la fixer. REMARQUE : Assurez-vous de placer la lamelle sur la lame avec le côté de la cellule vers le bas.</li>
	<li>Observez au microscope à fluorescence. REMARQUE : Utilisez un microscope à fluorescence ou un microscope confocal laser ; Ce dernier produit une imagerie plus sensible et plus claire.</li>
</ol>

FISH pour la localisation de l’ARN non codant long dans les cellules d’ostéosarcome humain

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression.">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li><li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation,+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346.">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li><li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation,+migration,+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells.">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li><li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function.">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li><li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer.">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a/RASSF6+axis.">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li><li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K/AKT+pathway.">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ceRNA+in+cancer:+possible+functions+and+clinical+implications.">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li><li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells.">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy.">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a/b+and+miR-214+in+colorectal+cancer.">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 12 (1), 3 (2019).</li><li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p.">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li><li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p/ULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma.">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82 (2019).</li><li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li><li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids.">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells.">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li><li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples.">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).</li><li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+RNA+FISH+(smFISH)+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs.">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole RNA FISH peut non seulement détecter la localisation des ARNlnc dans les cellules, mais aussi détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines dans les cellules, qui peuvent également être utilisés pour détecter l’emplacement des ARNlnc dans les tissus enrobés de paraffine. Cependant, le protocole spécifique dans de tels cas est différent car les tissus enrobés de paraffine doivent être déparaffinés21. Cette procédure expérimentale peut être appliquée da...

Notre compréhension du génome humain a été considérablement élargie par les progrès récents de la technologie du génome entier. Environ 93 % du génome humain peut être transcrit en ARN, mais seulement 2 % des ARN peuvent être traduits en protéines ; les 98 % restants d’ARN qui n’ont pas de fonction de traduction protéique sont appelés ARN non codant (ARNnc)1. En tant que classe d’ARN non codants (ARNnc), les ARNnc longs (ARNlnc), contenant plus de 200 nucléotides2, ont attiré une attention croissante en raison de leur implication dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques des cellules, tels que la différenciation, le contrôle du cycle, l’apoptose, la migration et l’invasion 3,4,5. Les ARNlnc jouent leur rôle par le biais de divers mécanismes, tels que la régulation de la structure de la chromatine et de l’expression des gènes nucléaires, le contrôle du processus d’épissage de l’ARNm et la modification post-transcriptionnelle6. Les ARNlnc régulent l’apparition, le développement et les métastases des tumeurs malignes aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel. La régulation transcriptionnelle est réalisée dans le noyau en affectant la transcription de l’ARN via la liaison aux structures chromosomiques, tandis que la régulation post-transcriptionnelle est réalisée dans le cytoplasme en contrôlant les gènes cibles via un mécanisme d’ARN compétitif endogène (ARNce) 5,7,8. L’ARNc a révélé un nouveau mécanisme d’interaction avec l’ARNc, à savoir que les ARNlnc peuvent agir comme une éponge pour adsorber les miARN et inhiber la dégradation médiée par les miARN des gènes cibles apparentés9. Par conséquent, les informations concernant la localisation subcellulaire des ARNlnc, qu’un ARNlnc spécifique soit situé dans le cytoplasme ou le noyau, sont importantes pour aider à identifier leurs fonctions biologiques.
À l’heure actuelle, la localisation de l’ARNlnc est principalement détectée par deux méthodes, l’une par test d’isolement de fraction noyau/cytoplasme, et l’autre par ARN FISH. Dans le premier cas, les ARN des fractions cytoplasmique et nucléaire sont extraits respectivement, puis l’amplification par PCR est réalisée avec des amorces d’ARNlnc spécifiques pour détecter le rapport des ARNlnc dans le cytoplasme et le noyau. L’avantage de cette méthode est l’efficacité temporelle, tandis que l’inconvénient est que la localisation réelle de l’ARNlnc n’est pas directement reflétée par la proportion relative d’ARNlnc dans le cytoplasme et le noyau. RNA FISH peut détecter la localisation de l’ARNlnc dans les cellules grâce à la conception de séquences de chaînes antisens spécifiques à l’ARNlnc, suivie d’un marquage avec des colorants fluorescents10. Les méthodes RNA FISH ont été améliorées grâce aux progrès des techniques de sonde et des méthodes de détection, y compris les ensembles de sondes à oligosondes multiplesmarquées aux fluorophores 11, les sondes LNA 12 et les sondes à ADN ramifié (ADNb)13. L’ARN FISH peut non seulement détecter la localisation de l’ARNlnc, mais aussi détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines en utilisant l’immunofluorescence bicolore ou multicolore14.
Dans ce travail, nous avons inclus le protocole détaillé de détection de localisation intracellulaire du gène hôte 6 (SNHG6) du petit ARN nucléolaire de l’ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome (143B) par RNA FISH à titre d’exemple. SNHG6 est un ARNlnc nucléotidique de 600 à 730 dans sa forme épissée mature et identifié comme un nouvel oncogène dans divers cancers humains, notamment le cancer colorectal, le cancer gastrique, le carcinome à cellules claires de l’ovaire, l’ostéosarcome et le carcinome hépatocellulaire15,16,17,18. Des études ont confirmé l’implication de SNHG6 dans les comportements biologiques des cellules cancéreuses, tels que la prolifération, l’EMT et l’autophagie, et ont montré la localisation cytoplasmique de SNHG6 où il peut affecter les gènes cibles en se liant (éponger) les miARN15,16,17. Ce protocole détaillé de détection de la localisation intracellulaire de SNHG6 par RNA FISH est présenté ici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>IC1000</td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate-12</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>3513,corning</td>
			<td>Place the coverslips in the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cell line (143B)</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td>osteosarcoma cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>&#160;430790, Corning</td>
			<td>Centrifuge the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>abs7026</td>
			<td>The cells are seeded on the coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 label-SNHG6 DNA probe</td>
			<td>Shanghai GenePharma Co.,Ltd</td>
			<td>A10005</td>
			<td>Detect SNHG6 location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>LM-E1141</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>DKT200-2&#160;</td>
			<td>Incubation at different high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%&#160;</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus</td>
			<td>Observation and positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td>
			<td>DHP-9051</td>
			<td>The samples were incubated at 37 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>E675004</td>
			<td>Attach the coverslips to the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>TS-8S</td>
			<td>Washing sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>188105</td>
			<td>The coverslips is placed on the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600198</td>
			<td>Permeable membrane and nuclear membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypsin (0.25%)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>25200056, Gibco</td>
			<td>trypsin treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600560</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna fluorescence in situ hybridization for long non-coding rna localization in human osteosarcoma cells

Les rôles importants des longs ARN non codants (ARNlnc) dans le cancer ont été étudiés, tels que la régulation de la prolifération, de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), de la migration, de l’infiltration et de l’autophagie des cellules cancéreuses. La détection de localisation des ARNlnc dans les cellules peut donner un aperçu de leurs fonctions. En concevant la séquence de chaîne antisens spécifique de l’ARNlnc suivie d’un marquage avec des colorants fluorescents, l’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN (FISH) peut être appliquée pour détecter la localisation cellulaire des ARNlnc. Avec le développement de la microscopie, les techniques RNA FISH permettent même aujourd’hui de visualiser les ARNlnc faiblement exprimés. Cette méthode permet non seulement de détecter la localisation des ARNlnc seuls, mais aussi de détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines en utilisant l’immunofluorescence bicolore ou multicolore. Ici, nous avons inclus la procédure d’opération expérimentale détaillée et les précautions de l’ARN FISH en utilisant le gène hôte 6 (SNHG6) du petit ARN nucléolaire de l’ARN lnc dans les cellules d’ostéosarcome humain (143B) à titre d’exemple, afin de fournir une référence pour les chercheurs qui souhaitent effectuer des expériences RNA FISH, en particulier lncRNA FISH.

Our understanding of the human genome has been greatly expanded by recent advances in whole-genome technology. About 93% of the human genome can be transcribed into RNAs, but only 2% of the RNAs can be translated into proteins; the remaining 98% of RNAs that have no protein translation function are called non-coding RNA (ncRNA)1. As a class of noncoding RNAs (ncRNAs), long ncRNAs (lncRNAs), containing over 200 nucleotides2, have attracted increasing attention due to their involvement in many physiological and pathological processes of the cells, such as differentiation, cycle control, apoptosis, migration, and invasion3,4,5. LncRNAs play their roles through various mechanisms, such as regulating chromatin structure and nuclear gene expression, controlling the mRNA splicing process, and posttranscriptional modification6. LncRNAs regulate the occurrence, development, and metastasis of malignancies at both the transcriptional and posttranscriptional levels. Transcriptional regulation is realized in the nucleus by affecting RNA transcription via binding to the chromosomal structures, while posttranscriptional regulation is realized in the cytoplasm by controlling the target genes via an endogenous competitive RNA (ceRNA) mechanism5, 7, 8. CeRNA has revealed a new mechanism of RNA interaction, namely that lncRNAs can act as a sponge to adsorb miRNAs and inhibit the miRNA-mediated degradation of related target genes9. Therefore, the information regarding the subcellular localization of lncRNAs, whether a specific lncRNA is located in the cytoplasm or nucleus, is important to help identify their biological functions.
At present, lncRNA localization is mainly detected by two methods, one is by nucleus/cytoplasm fraction isolation assay, and the other is by RNA FISH. In the former, RNAs in the cytoplasmic and the nuclear fractions are extracted respectively, and then PCR amplification is performed with specific lncRNA primers to detect the ratio of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. The advantage of this method is time efficiency, while the disadvantage is that the actual lncRNA localization is not directly reflected by the relative proportion of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. RNA FISH can detect lncRNA localization in cells through the design of lncRNA-specific antisense chain sequences followed by labeling with fluorescent dyes10. The RNA FISH methods have been improved with advances in probe techniques and detection methods, including fluorophore-labeled multiple oligo probe sets11, LNA probes12, and branched-DNA (bDNA) probes13. RNA FISH can not only detect the localization of lncRNA, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence14.
In this work, we have included the detailed intracellular localization detection protocol of lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in osteosarcoma cells (143B) by RNA FISH as an example. SNHG6 is a 600-730 nucleotide lncRNA in its mature spliced form and identified as a novel oncogene in diverse human cancers, including colorectal cancer, gastric cancer, ovarian clear cell carcinoma, osteosarcoma, and hepatocellular carcinoma15,16,17,18. Studies have confirmed the involvement of SNHG6 in biological behaviors of cancer cells, such as proliferation, EMT, and autophagy, and shown the cytoplasmic localization of SNHG6 where it may affect the target genes by binding (sponging) the miRNAs15,16,17. This detailed detection protocol of SNHG6 intracellular localization by RNA FISH is presented herein.

Pleins feux sur l’auteur : ARN FISH pour localiser lncRNA-SNHG6 dans les cellules d’ostéosarcome 

Hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour la localisation de longs ARN non codants dans les cellules d’ostéosarcome humain

The scope of our research is to provide a detailed RNA FISH protocol that's providing a reference for scientists who want to perform RNA FISH experiments. Our research has established that RNA FISH can be used to localize lncRNA in human osteosarcoma cells. Our protocol provided a comprehensive experimental procedure and the precautions for RNA FISH using lncRNA-SNHG6 in human osteosarcoma cells as a reference.

Des images représentatives de SNHG6 FISH dans des cellules d’ostéosarcome humain sont présentées (Figure 2). Le contrôle négatif est traité avec la sonde Ctrl négative ; Le contrôle positif est traité avec la sonde U6 20. La sonde SNHG6 et la sonde U6 sont marquées avec Cy3, qui émet une fluorescence rouge. Le DAPI est un colorant qui colore l’ADN, qui émet une fluorescence bleue. Ce résultat montre que SNHG6 est principalement localisé dans le cyto...

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Le présent protocole décrit une méthode d’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour localiser les ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome humain.

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

L’objectif de notre recherche est de fournir un protocole ARN FISH détaillé qui fournit une référence pour les scientifiques qui souhaitent effectuer des expériences RNA FISH. Nos recherches ont établi que l’ARN FISH peut être utilisé pour localiser l’ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome humain. Notre protocole a fourni une procédure expérimentale complète et les précautions pour l’ARN FISH en utilisant lncRNA-SNHG6 dans des cellules d’ostéosarcome humain comme référence.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

1.0K vues.  Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. L’objectif de notre recherche est de fournir un protocole ARN FISH détaillé qui fournit une référence pour les scientifiques qui souhaitent effectuer des expériences RNA FISH. Nos recherches ont établi que l’ARN FISH peut être utilisé pour localiser l’ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome humain. Notre protocole a fourni une procédure expérimentale complète et les précautions pour l’ARN FISH en utilisant lncRNA-SNHG6 dans des cellules d’ostéosarcome humain comme r?...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : ARN FISH pour localiser lncRNA-SNHG6 dans les cellules d’ostéosarcome 

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), migration, infiltration, and autophagy of cancer cells. Localization detection of lncRNAs in cells can provide insight into their functions. By designing the lncRNA-specific antisense chain sequence followed by labeling with fluorescent dyes, RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be applied to detect the cellular localization of lncRNAs. Together with the development of microscopy, the RNA FISH techniques now even allow for visualization of the poorly expressed lncRNAs. This method can not only detect the localization of lncRNAs alone, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence. Here, we have included the detailed experimental operation procedure and precautions of RNA FISH by using lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in human osteosarcoma cells (143B) as an example, to provide a reference for researchers who want to perform RNA FISH experiments, especially lncRNA FISH.

The present protocol describes a method of RNA fluorescence in situ hybridization to localize the lncRNAs in human osteosarcoma cells.

Recherche

Recherche en cancérologie

RNA Fluorescence In Situ Hybridization to Localize the lncRNAs in Human Osteosarcoma Cells

To begin, after acquiring the long non-coding RNA of interest, incubate the hybridization buffer at 37 degrees Celsius for two hours. Next, dissolve the four optical density probe in 160 microliters of diethyl pyrocarbonate treated deionized water away from the light. Prepare 200 microliters of the probe mixture for each well, and set up a series of 50, 25, 12.5, and six micrograms per milliliter.Denature the probe mix at 73 degrees Celsius for five minutes. Take a 12-well cell culture plate containing 143B cells on sterile glass cover slips. Remove the medium and wash twice for five minutes with PBS.Place the cells on a shaker. Then remove the PBS and add 200 microliters of 100%ethanol to each well, fixing for 15 minutes at room temperature. Then remove the ethanol, add 200 microliters of 0.1%Triton X-100 to each well, and incubate for 15 minutes at room temperature.Remove 0.1%Triton X-100 and wash two times for five minutes with PBS. Next, remove PBS, add 200 microliters of two times sodium-saline citrate or SSC buffer into each well, and incubate for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Remove two times SSC buffer, add 200 microliters of 70%ethanol into each well, and incubate for three minutes at room temperature.Discard the 70%ethanol, then add 200 microliters of 85%ethanol into each well and incubate for three minutes at room temperature. Next, discard the 85%ethanol, add 200 microliters of 100%ethanol to each well, and incubate for three minutes at room temperature. Afterward, absorb and discard the 100%ethanol and allow the wells to dry.Next, add 200 microliters of denatured probe mixture to each well, then incubate at 37 degrees Celsius overnight. The following day, remove samples from 37 degrees Celsius, discard the probe mixture, and add 200 microliters of preheated 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Remove the 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer.Add 200 microliters of two times SSC 0.1%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Next, discard the two times SSC 0.1%Tween 20 buffer. Add 200 microliters of DAPI staining solution and stain for 20 minutes in the dark on a shaker.After staining, discard the DAPI solution and wash it with PBS for two minutes at room temperature. Lastly, add 50 microliters of mounting medium containing gum to the slide and place the glass cover slip to fix the slide. Representative SNHG6 FISH images in human osteosarcoma cells are shown.SNHG6 probe labeled with Cy3, which emits red fluorescence, showed that SNHG6 is mainly localized in the cytoplasm. A background color was observed when using a high concentration of probe.