Après avoir construit et aligné le système de microscope à deux photons sensible à la polarisation, selon la représentation schématique affichée, testez la qualité de l’alignement optique avec un échantillon de référence isotrope comme la fluorescéine incorporée dans un polymère amorphe. Pour ce faire, allumez le laser d’excitation et mesurez les graphiques polaires à 360 degrés de l’échantillon de référence pour une plaque demi-onde nulle. Ajustez l’angle de la plaque demi-onde pour qu’il corresponde aux axes X et Y du plan d’échantillonnage et vérifiez si les deux photodiodes collectent des intensités similaires de deux composantes d’émission excitées par photon.
Pour analyser l’échantillon, montez la lame de verre avec cet échantillon de sphérulite sur la platine piézoélectrique, en veillant à ce que la face de la lame contenant la lamelle de recouvrement fasse face à l’objectif d’immersion à ouverture numérique élevée. Fixez ensuite la lame de verre avec du ruban adhésif. Ensuite, en ajustant les positions X, Y et Z à l’aide des boutons du microscope, concentrez l’objectif sur la sphérulite dans la solution.
Concentrez-vous spécifiquement sur la zone centrale de l’ensemble de la structure, car les diamètres des sphérulites sont généralement de l’ordre de quelques dizaines de microns. Centrez ensuite cette sphérulite dans le champ de vision dans le plan du microscope. Déterminez la taille du balayage XY en ajustant le nombre d’étapes de la platine piézoélectrique dans les directions X et Y pour couvrir toute la surface de la structure.
Ajustez les paramètres de la platine piézoélectrique tels que la vitesse de numérisation, la taille du pas et la portée pour couvrir la zone de l’ensemble de la sphérulite. Ouvrez l’obturateur, allumez les photodiodes et collectez les composantes d’émission X et Y de l’intensité de fluorescence excitée à deux photons pour chaque étape de la zone de balayage sélectionnée pour le faisceau d’excitation polarisé correspondant aux axes X puis Y. Scannez ensuite cet échantillon de sphérulite, ce qui donne une fluorescence excitée à deux photons.
Pour effectuer une analyse complète de la polarisation à partir d’un point spécifique de l’échantillon, désactivez le faisceau d’excitation. Prenez les coordonnées spécifiques de l’étage piézoélectrique correspondant à l’emplacement choisi sur cette sphérulite où l’information sur l’orientation des molécules est requise avec une résolution submicronique. Ajustez la platine piézoélectrique pour centrer le champ de vision aux coordonnées X et Y indiquées.
Après avoir allumé le faisceau d’excitation, activez la rotation de 180 degrés de la plaque demi-onde pour effectuer une analyse complète de polarisation à 360 degrés des composantes d’émission X et Y de l’émission de fluorescence excitée à deux photons. L’image de la sphérulite d’insuline obtenue après l’exécution d’un balayage matriciel 2PFM était cohérente avec celles rapportées pour une spherulite. La position de la plaque demi-onde correspondant à l’excitation de l’échantillon le long des axes X et Y a également été vérifiée.
Les diagrammes polaires ont changé lors de l’exécution d’une analyse complète de la polarisation à partir de différents points sélectionnés. À l’extérieur de la sphérulite, le graphe de la PLO ressemblait à une collection d’artefacts et de pics de bruit de signal aléatoires. Les polygraphes correctement mesurés à partir d’emplacements hautement ordonnés le long des axes X et Y avaient des formes et des géométries différentes en fonction de l’orientation et de l’organisation locales des fluorophores.
