Pour commencer, avec un scalpel, faites une incision le long de la ligne médiane dorsale d’une souris euthanasiée, de la région occipitale à la région sacrée. À l’aide d’un microscope chirurgical stéréoscopique, disséquez soigneusement les couches jusqu’à la colonne lombaire. Identifiez la dernière arcade costale.
Identifiez la dernière vertèbre cervicale et le sacrum. Faites ensuite une incision pour séparer la colonne vertébrale. À l’aide d’une pince à dissectionner, effectuez une laminectomie dorsale de la vertèbre pour extraire la moelle épinière.
Enlever les nerfs émergeant à travers les foramens qui constituent le système nerveux périphérique. Maintenant, placez la moelle épinière extraite sur une planche à disséquer. À l’aide d’une paire de ciseaux vannas, coupez-le en morceaux de deux millimètres.
Transférez ensuite les morceaux dans un microtube à fond plat de deux millilitres. Ajouter un millilitre de solution de travail HBSS-LD au microtube. Incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes.
Assurez-vous de faire vortex vigoureusement le mélange toutes les cinq minutes. Ensuite, passez le contenu de chaque digestion dans une passoire de 40 microns. Ajoutez ensuite sept millilitres d’HBSS avec 2% FBS pour neutraliser la digestion et écraser les tissus restants.
Transférez la suspension dans un tube conique de 50 millilitres avant de la centrifuger à 220 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Utilisez maintenant une micropipette d’un millilitre pour éliminer le surnageant. Ensuite, remettez le granulé en suspension dans deux millilitres de HBSS-FBS dans un nouveau tube conique de 15 millilitres.
Ajoutez deux millilitres de milieu à gradient de densité isotonique à 90 % dans le tube et centrifugez le mélange à 160 g pendant 25 minutes à 18 degrés Celsius. Enfin, à l’aide d’une pipette de transfert, récupérez l’interphase et transférez-la dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS, puis centrifugez les cellules à 220 g pendant cinq minutes à cinq degrés Celsius avant de poursuivre l’expérimentation.
La purification des cellules microgliales extraites a permis d’obtenir jusqu’à 99 % de rendement cellulaire, comme le confirme la coloration FACS. Des cellules doubles positives d’une taille moyenne de 10 micromètres compatibles avec une microglie non activée ont été observées.
