Ce travail a été soutenu par des subventions de la bourse accordée par le Conseil national de la science et de la technologie (CONACYT) (702361). Les auteurs reconnaissent le programme de doctorat en sciences biologiques et chimiques de l’École nationale des sciences biologiques de l’Institut national polytechnique.

L’étude a été menée conformément à la norme officielle mexicaine NOM-062-ZOO-1999 et au guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. L’approbation de l’étude a été obtenue auprès des comités de recherche, d’éthique et de biosécurité de l’hôpital pour enfants de Mexico (HIM/2023/006) et du comité de recherche et de bioéthique de l’hôpital général de Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Trois souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines ont été obtenues de l’hôpital pour enfants de Mexico, où elles ont été élevées dans des conditions isolées dans des racks ventilés, conformément aux directives institutionnelles en matière de soins et d’utilisation des animaux.
1. Préparation des matériaux et des réactifs
<ol><li>Préchauffer le PBS sans Ca 2+ et Mg2+ ainsi que la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 37 °C.</li>
	<li>Compléter la solution HBSS avec 100 μg/mL de Liberase et 4 μg/mL de DNase (HBSS-LD). Assurez-vous que la solution maintient un pH physiologique de 7,4. REMARQUE : 1 mL de solution de travail par moelle épinière sera nécessaire.</li>
	<li>Préparez une solution isotonique à 90 % pour la centrifugation à gradient de densité (disponible dans le commerce, voir le tableau des matériaux) et préchauffez-la à 37 °C.</li>
	<li>Préparez le tampon de coloration en combinant du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS) à 5 % avec du PBS et conservez le mélange sur de la glace.</li>
	<li>Préchauffer le Modified Eagle’s de Dulbecco à une glycémie moyennement élevée (1 g/L) (DMEM) à 37 °C.</li>
	<li>Complétez le milieu DMEM avec 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 200 U/mL de pénicilline, 200 μg/mL de streptomycine et 500 pg/mL d’amphotéricine B (voir le tableau des matériaux) pour préparer le DMEM-S.</li>
</ol>2. Dissection et préparation de la moelle épinière
<ol><li>Euthanasier la souris avec un surdosage intrapéritonéal de pentobarbital à une dose de 150 mg / kg. Stérilisez le thorax et le dos de la souris avec de l’éthanol à 70 %. REMARQUE : Confirmer que l’euthanasie a réussi avant de procéder à la dissection chez la souris.</li>
	<li>Rasez la région thoraco-lombaire et fixez les extrémités à la planche de dissection à l’aide de ruban adhésif.</li>
	<li>À l’aide d’un scalpel, faites une incision soigneuse le long de la ligne médiane dorsale, de la région occipitale à la région sacrée (figure 2).</li>
	<li>À l’aide d’un microscope chirurgical stéréoscopique, disséquer en couches jusqu’à atteindre la colonne lombaire et identifier la dernière arcade costale. REMARQUE : Les 13 arcs costaux sont articulés dans les vertèbres thoraciques ; lorsqu’elles sont disséquées, elles deviennent visibles supérieures à la vertèbre L12.</li>
	<li>Déterminez la dernière vertèbre cervicale et le sacrum, puis faites une incision pour séparer la colonne vertébrale (Figure 2).</li>
	<li>À l’aide d’une pince à disséquer, effectuer une laminectomie dorsale des vertèbres pour extraire la moelle épinière (figure 3A-D). REMARQUE : À l’exception des deux premières vertèbres cervicales (atlas et axe), toutes les vertèbres mobiles partagent une conception morphologique commune dans diverses régions (cervicale, thoracique ou lombaire). Chaque vertèbre mobile typique présente un corps vertébral cylindrique à son extrémité antérieure. Attaché à l’arrière du corps se trouve un arc osseux connu sous le nom d’arc vertébral (arc neural), composé de lames et d’apophyses épineuses. Entre ces structures se trouve le foramen vertébral15.</li>
	<li>Enlever les nerfs émergeant à travers les foramens (racines dorsale et ventrale) qui constituent le système nerveux périphérique et peuvent contenir des macrophages infiltrés (Figure 3D). REMARQUE : Il n’est pas nécessaire d’enlever la pie-mère ou les méninges car le milieu de gradient de densité élimine efficacement les astrocytes contaminants. De plus, la conservation des méninges réduit le temps de purification et améliore la viabilité.</li>
</ol>3. Digestion tissulaire et isolement de la microglie
<ol><li>Placez la moelle épinière sur la planche à disséquer et, à l’aide de ciseaux Vannas, coupez la moelle épinière en morceaux de 2 mm, ce qui donne une moyenne de 10 morceaux.</li>
	<li>Transférez les sections de la moelle épinière dans un microtube à fond plat de 2 ml (figures 3E et F).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de la solution de travail HBSS-LD (étape 1.2). Incuber à 37 °C pendant 25 min, en vortex vigoureusement toutes les 5 min.</li>
	<li>Passer le contenu de chaque digestion dans une passoire de 40 μm, puis ajouter 7 mL d’HBSS avec 2 % de FBS pour neutraliser la digestion.</li>
	<li>Écraser le reste du tissu à l’aide d’un piston de seringue de 1 ml. Centrifuger la suspension dans un tube conique de 50 mL pendant 5 min à 220 x g, 4 °C.</li>
	<li>Jeter le surnageant à l’aide d’une micropipette de 1 mL et remettre le pastille en suspension dans 2 mL d’HBSS avec 2 % de FBS dans un tube conique de 15 mL. Mélanger avec 2 mL de milieu à gradient de densité isotonique à 90 %. Centrifuger pendant 25 min à 160 x g, 18 °C. REMARQUE : Utilisez une accélération lente et évitez d’utiliser le frein.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de transfert, récupérer l’interface et la transférer dans un tube conique de 15 mL. Laver les cellules avec 10 mL de PBS et centrifuger pendant 5 min à 220 x g, 4 °C.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans DMEM-S (étape 1.6) et les conserver sur de la glace.</li>
</ol>4. Détermination de la pureté et de la viabilité
<ol><li>Pour quantifier les cellules viables à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre, utilisez une coloration au bleu trypan à 0,4 % (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : En moyenne, une seule souris fournit 4 à 6 millions de cellules.</li>
	<li>Pour quantifier les cellules viables à l’aide d’un cytomètre en flux, utilisez un colorant fluorescent réactif aux amines disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).<ol><li>Transférez 1 million de cellules dans un tube de 5 ml en polystyrène à fond rond (FACS). Diluer le colorant fluorescent avec du PBS dans un rapport de 1 :1000 (pour créer la solution de travail de viabilité).</li>
		<li>Incuber les échantillons avec la solution de viabilité dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Lavez les cellules avec du PBS glacé deux fois. Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de coloration (étape 1.4).</li>
		<li>Bloquer les cellules avec de l’anti-FcRIII/I 2.4G2 (voir tableau des matériaux) dans le tampon de coloration glacé pendant 15 min à 4 °C.</li>
		<li>Formuler le cocktail de coloration des anticorps en ajoutant les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence CD45-PerCP et CD11b-eFluor 450 au tampon de coloration (à une dilution de 1 :300) (voir tableau des matériaux). REMARQUE : Bien que les deux techniques soient disponibles, choisissez celle qui correspond le mieux au protocole suivant.</li>
		<li>Incuber les échantillons avec le cocktail de coloration d’anticorps dans l’obscurité à 4 °C pendant 30 min. Lavez deux fois les cellules avec un tampon de coloration glacé. Remettre les cellules en suspension dans 400 μL de tampon de coloration.</li>
		<li>Acquérir 250 000 événements sur un cytomètre en flux, comme indiqué dans la stratégie de déclenchement à l’étape 6 (Figure 4).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Coloration immunofluorescente
<ol><li>Placez une lamelle prétraitée dans un puits d’une plaque à 6 puits. REMARQUE : Pour traiter les lamelles, les placer dans une boîte de Pétri avec 500 μL de solution de L-polylysine (0,01 mg/mL, voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 1 h. Ensuite, lavez-les trois fois avec de l’eau distillée et laissez-les sécher.</li>
	<li>Ensemencer 200 000 cellules sur la lamelle traitée à l’aide de 500 μL de solution DMEM-S. Incuber pendant 24 h.</li>
	<li>Retirez les lamelles et fixez les cellules à l’aide de paraformaldéhyde (PFA) à 3,7 % pendant 20 min à température ambiante. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS glacé.</li>
	<li>Perméabiliser les cellules avec 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, lavez les lamelles trois fois avec du PBS froid. Bloquer les cellules avec 0,2 % de BSA dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Diluer les anticorps monoclonaux marqués par fluorescence (à une dilution de 1 :300, voir tableau des matériaux) dans la solution bloquante et incuber pendant 1 h à température ambiante. Lavez les lamelles trois fois avec du PBS glacé.</li>
	<li>Appliquez un support de montage contenant du DAPI sur la lame, puis scellez-la avec une lamelle. REMARQUE : Les lames peuvent être immédiatement analysées à l’aide d’un microscope à fluorescence ou confocal, ou elles peuvent être stockées jusqu’à 3 mois à -20°C.</li>
</ol>6. Stratégie de déclenchement pour la microglie de la moelle épinière
<ol><li>Générez un diagramme à points et établissez une porte pour isoler les cellules viables en fonction de la coloration de la viabilité et d’un canal fluorescent vide16. Exclure les cellules non viables.</li>
	<li>Produire un autre tracé en utilisant les paramètres de diffusion vers l’avant et sur les côtés pour éliminer les débris16.</li>
	<li>Développer un diagramme à points supplémentaire et analyser l’expression de CD11b et CD45 pour différencier la microglie.</li>
</ol>

Extraction et purification enzymatique de la microglie de la moelle épinière de souris

<ol>
	<li>Schr&#246;der, H., Schr&#246;der, , Moser, , Huggenberger, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).</li><li>Sengul, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+of+the+spinal+cord+of+the+postnatal+(P4)+mouse.">Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse.</a> Anat Rec. 295, 837-845 (2012).</li><li>Bab, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).</li><li>Nayak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+development+and+function.">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li><li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, 453-461 (2008).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+biology:+one+century+of+evolving+concepts.">Microglia biology: one century of evolving concepts.</a> Cell. 179 (2), 292-311 (2019).</li><li>de Haas, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS.">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li><li>Xuan, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+of+microglia+in+the+brain+and+the+spinal+cord.">Differences of microglia in the brain and the spinal cord.</a> Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).</li><li>Paolicelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+states+and+nomenclature:+A+field+at+its+crossroads.">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+IL-36&#947;/IL-36R+participates+in+the+maintenance+of+chronic+inflammatory+pain+through+astroglial+JNK+pathway.">Spinal IL-36&#947;/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway.</a> Glia. 67 (3), 438-451 (2019).</li><li>Prinz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+central+nervous+system-associated+macrophages-from+origin+to+disease+modulation.">Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation.</a> Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).</li><li>Yip, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).</li><li>Akhmetzyanova, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity-+and+time-dependent+activation+of+microglia+in+spinal+cord+injury.">Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury.</a> Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).</li><li>Mahadevan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+vertebral+column.">Anatomy of the vertebral column.</a> Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).</li><li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+microglia-depletion+after+cosmic+radiation+modifies+phagocytic+activity+and+prevents+cognitive+deficits.">Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits.</a> Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Schmidt, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+enzymatic+efficiency+of+Liberase+TM+and+tumor+dissociation+enzyme:+effect+on+the+viability+of+cells+digested+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+cortex.">Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex.</a> Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).</li><li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoNEET-parkin+effects+in+pancreatic+&#945;-+and+&#946;-cells,+cellular+survival,+and+intrainsular+cross+talk.">MitoNEET-parkin effects in pancreatic &#945;- and &#946;-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk.</a> Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

De nombreux protocoles ont été développés pour l’étude de la microglie en raison de leur importance dans l’homéostasie cérébrale. Dans ces méthodes, les microglies proviennent généralement des hémisphères cérébraux de rats et de souris embryonnaires ou néonatals17. Un nombre limité d’études ont porté sur la purification de la microglie de la moelle épinière de souris adultes13,14. Ces techniques impliquent une di...

La caractéristique déterminante des vertébrés est la colonne vertébrale ou colonne vertébrale, dans laquelle la notochorde a été remplacée par une séquence d’os segmentés appelés vertèbres, divisés par des disques intervertébraux. Cette succession de matière osseuse façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière1. Dans le genre Rodentia, la colonne vertébrale est généralement formée de sept vertèbres cervicales, treize vertèbres thoraciques, six vertèbres lombaires et un nombre variable de vertèbres caudales 2,3. La longueur de la moelle épinière est similaire à celle de la colonne vertébrale et le filum terminal est une structure non nerveuse qui ancre la moelle épinière au sacrum. De plus, les fibres nerveuses sortent par le foramen intervertébral1.
Le développement et le bon fonctionnement du système nerveux central chez les mammifères dépendent de manière critique de l’activité des macrophages résidents du système nerveux, appelés microglie4. Bien que les microglies aient été initialement décrites comme des phagocytes résidents du cerveau, des recherches récentes ont attribué de nombreuses fonctions dynamiques à ces cellules 5,6. La taille de la microglie varie de 7 à 10 μm en homéostasie ; Elles sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme et peuvent s’adapter morphologiquement et fonctionnellement à leur environnement en constante évolution7. Ces cellules présentent une forte hétérogénéité au stade embryonnaire et au stade adulte8,9, tandis qu’au stade adulte, elles présentent également une hétérogénéité fonctionnelle complexe en fonction de leur contexte spatio-temporel10. L’hétérogénéité et les multiples fonctions de la microglie permettent une expression et un comportement différentiels des gènes dans la moelle épinière et le cerveau. Il a été démontré que l’expression de CD11b, CD45, CD86 et CCR9 est plus élevée dans la moelle épinière que dans le cerveau 8,9.
Il existe plusieurs protocoles pour l’isolement de la microglie cérébrale11,12 ; cependant, il n’en existe que quelques-uns pour la microglie de la moelle épinière13,14. L’optimisation d’une méthode de purification de la microglie de la moelle épinière facilite le développement de multiples études axées sur la découverte de la physiologie de la microglie. Ce protocole vise à décrire une extraction simple et hautement reproductible de la moelle épinière de souris et la purification de la microglie (Figure 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtubes</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>MCT-200-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2 anti-FcR</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse</td>
			<td>eBioscience, USA</td>
			<td>48-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45 PerCP anti-mouse&#160;&#160;</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>CLS3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heating Shaking Drybath&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps for microsurgery</td>
			<td>FT by DUMONT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>4536282001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium-high glucose (DMEM)&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Thermo, USA</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Alemania</td>
			<td>P30-3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer Cytoflex&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA&#160;</td>
			<td>15393631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM&#160;</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber Counting Chambers</td>
			<td>China</td>
			<td>1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>17089101</td>
			<td>density gradient centrifugation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel No. 25&#160;</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td>H23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>10011-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Velab, Mexico</td>
			<td>HG927831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors (10 cm)</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Vannas scissors</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain 0.4%&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DLAB, China</td>
			<td>8031102000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>423102</td>
			<td>amine-reactive fluorescent dye staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient enrichment of mouse spinal cord microglia

La colonne vertébrale définit un vertébré et façonne le canal rachidien, une cavité qui entoure et protège la moelle épinière. Le bon développement et le bon fonctionnement du système nerveux central des mammifères dépendent en grande partie de l’activité des macrophages résidents connus sous le nom de microglies. Les microglies présentent une hétérogénéité et une multifonctionnalité, permettant une expression et un comportement géniques distincts dans la moelle épinière et le cerveau. De nombreuses études ont exploré la fonction de la microglie cérébrale, détaillant abondamment les méthodes de purification. Cependant, la purification de la microglie de la moelle épinière chez la souris manque d’une description complète. En revanche, l’utilisation d’une collagénase hautement purifiée, par opposition à un extrait non raffiné, manque de rapports dans les tissus du système nerveux central. Dans cette étude, la colonne vertébrale et la moelle épinière ont été excisées chez des souris C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines. La digestion subséquente a utilisé une collagénase hautement purifiée, et la purification de la microglie a utilisé un gradient de densité. Les cellules ont subi une coloration pour la cytométrie en flux, évaluant la viabilité et la pureté par coloration CD11b et CD45. Les résultats ont donné une viabilité moyenne de 80 % et une pureté moyenne de 95 %. En conclusion, la manipulation de la microglie de souris a impliqué une digestion avec une collagénase hautement purifiée, suivie d’un gradient de densité. Cette approche a effectivement produit d’importantes populations de microglies de la moelle épinière.

The defining characteristic of vertebrates is the vertebral column or spine, in which the notochord has been replaced by a sequence of segmented bones called vertebrae, divided by intervertebral discs. This succession of osseous material shapes the spinal canal, a cavity that encloses and protects the spinal cord1. In the genus Rodentia, the spine is usually formed by seven cervical vertebrae, thirteen thoracic vertebrae, six lumbar vertebrae, and a variable number of caudal vertebrae2,3. The length of the spinal cord is similar to that of the spine, and the terminal filum is a non-nervous structure that anchors the spinal cord to the sacrum. Additionally, nerve fibers exit through the intervertebral foramen1.
The development and proper function of the central nervous system in mammals critically depend on the activity of the nervous system&#39;s resident macrophages, called microglia4. Although microglia were initially described as brain resident phagocytes, recent research has attributed many dynamic functions to these cells5,6. Microglia&#39;s size ranges from 7 to 10 &#181;m in homeostasis; they are considered among the most versatile cells in the body and can adapt morphologically and functionally to their constantly changing environment7. These cells exhibit high heterogeneity during both the embryonic and adult stages8,9, while in the adult stage, they also display complex functional heterogeneity based on their spatiotemporal context10. The heterogeneity and multiple functions of microglia allow for differential gene expression and behavior in the spinal cord and brain. It has been shown that CD11b, CD45, CD86, and CCR9 expression is higher in the spinal cord compared to the brain8,9.
Multiple protocols exist for cerebral microglia isolation11,12; however, only a few exist for spinal cord microglia13,14. Optimizing a method for purifying microglia from the spinal cord facilitates the development of multiple studies focused on discovering microglia physiology. This protocol aims to describe a simple and highly reproducible extraction of the mouse spinal cord and the purification of microglia (Figure 1).

Pleins feux sur l’auteur : Recherche sur la microglie sur l’hétérogénéité et la purification de la moelle épinière 

Enrichissement rapide et efficace de la microglie de la moelle épinière de souris

Our research focuses on the heterogeneity of microglia, which can exhibit both pro and anti-inflammatory behaviors across different pathologies and regions like the brain and spinal cord. We aim to enable a deeper understanding of spinal cord microglia behavior in diverse scenarios. The heterogeneity of microglia has made it difficult to classify them.This year, a new and broad classification has been proposed that goes beyond just a pro or anti-inflammatory status. Currently, achieving high purity and gel in isolating spinal cord microglia from animal models of neurological pathologies is a significant experiment and challenge. We identified a novel cytokine signaling pathway in the spinal cord microglia during chronic pain.Our protocol allows for a more controlled and somatic digestion, followed by a density gradient. Both result in less contamination by astrocytes compared to currently employed techniques for the purification of microglia from the spinal cord, brain, or embryos.

En utilisant du tissu de moelle épinière de souris, la digestion enzymatique a été réalisée à l’aide d’un mélange hautement enrichi en collagénase et en thermolysine. Le tissu digéré qui en résulte passe à travers un filtre de 40 μm pour éliminer les matières non digérées. Les cellules collectées ont été enrichies par un gradient de densité de Percoll, avec 90 % dans la partie inférieure et 45 % dans la partie supérieure. Les cellules enrichies en microglie à l’intérieur de l’interface o...

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Les microglies sont considérées comme l’une des cellules les plus polyvalentes de l’organisme, capables d’adaptation morphologique et fonctionnelle. Leur hétérogénéité et leur multifonctionnalité permettent le maintien de l’homéostasie cérébrale, tout en étant liées à diverses pathologies neurologiques. Ici, une technique de purification de la microglie de la moelle épinière est décrite.

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...

Nos recherches se concentrent sur l’hétérogénéité de la microglie, qui peut présenter à la fois des comportements pro et anti-inflammatoires dans différentes pathologies et régions comme le cerveau et la moelle épinière. Notre objectif est de permettre une compréhension plus approfondie du comportement de la microglie de la moelle épinière dans divers scénarios. L’hétérogénéité des microglies a rendu difficile leur classification.Cette année, une nouvelle et large classification a été proposée qui va au-delà d’un simple statut pro ou anti-inflammatoire. À l’heure actuelle, l’obtention d’une grande pureté et d’un gel dans l’isolement de la microglie de la moelle épinière à partir de modèles animaux de pathologies neurologiques est une expérience et un défi importants. Nous avons identifié une nouvelle voie de signalisation des cytokines dans la microglie de la moelle épinière au cours de la douleur chronique.Notre protocole permet une digestion plus contrôlée et somatique, suivie d’un gradient de densité. Les deux entraînent moins de contamination par les astrocytes par rapport aux techniques actuellement utilisées pour la purification de la microglie de la moelle épinière, du cerveau ou des embryons.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

1.2K vues.  Mexico Children's Hospital. Nos recherches se concentrent sur l’hétérogénéité de la microglie, qui peut présenter à la fois des comportements pro et anti-inflammatoires dans différentes pathologies et régions comme le cerveau et la moelle épinière. Notre objectif est de permettre une compréhension plus approfondie du comportement de la microglie de la moelle épinière dans divers scénarios. L’hétérogénéité des microglies a rendu difficile leur classification.Cette année, une nouvelle et la...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Recherche sur la microglie sur l’hétérogénéité et la purification de la moelle épinière 

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and function of the mammalian central nervous system rely significantly on the activity of resident macrophages known as microglia. Microglia display heterogeneity and multifunctionality, enabling distinct gene expression and behavior within the spinal cord and brain. Numerous studies have explored cerebral microglia function, detailing purification methods extensively. However, the purification of microglia from the spinal cord in mice lacks a comprehensive description. In contrast, the utilization of a highly purified collagenase, as opposed to an unrefined extract, lacks reporting within central nervous system tissues. In this study, the vertebral column and spinal cord were excised from 8-10 week-old C57BL/6 mice. Subsequent digestion employed a highly purified collagenase, and microglia purification utilized a density gradient. Cells underwent staining for flow cytometry, assessing viability and purity through CD11b and CD45 staining. Results yielded an average viability of 80% and a mean purity of 95%. In conclusion, manipulation of mouse microglia involved digestion with a highly purified collagenase, followed by a density gradient. This approach effectively produced substantial spinal cord microglia populations.

Microglia are regarded as some of the most versatile cells in the body, capable of morphological and functional adaptation. Their heterogeneity and multifunctionality enable the maintenance of brain homeostasis, while also being linked to various neurological pathologies. Here, a technique for purifying spinal cord microglia is described.

Recherche

Neurosciences

Liberase-Based Enzymatic Purification of Microglial Cells Isolated from a Mouse Spinal Cord

To begin, with a scalpel, make an incision along the dorsal midline of a euthanized mouse from the occipital to the sacral region. Using a stereoscopic surgical microscope, carefully dissect through layers until the lumbar spine. Identify the last costal arch.Identify the last cervical vertebra and the sacrum. Then make a cut to separate the spine. With a pair of dissecting forceps, perform a dorsal laminectomy of the vertebra to extract the spinal cord.Remove the nerves emerging through the foramina which constitute the peripheral nervous system. Now, place the extracted spinal cord on a dissecting board. With a pair of vannas scissors, cut it into two-millimeter sized pieces.Then transfer the pieces to a two-milliliter flat-bottomed microtube. Add one milliliter of HBSS-LD working solution to the microtube. Incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 25 minutes.Make sure to vigorously vortex the mixture every five minutes. Next, pass the contents of each digestion through a 40-micron-size strainer. Then add seven milliliters of HBSS with 2%FBS to neutralize the digestion and crush the remaining tissue.Transfer the suspension to a 50-milliliter conical tube before centrifuging it at 220 g for five minutes at four degrees Celsius. Now use a one-milliliter micropipette to discard the supernatant. Then resuspend the pellet in two milliliters of HBSS-FBS in a new 15-milliliter conical tube.Add two milliliters of 90%isotonic density gradient medium to the tube, and centrifuge the mixture at 160 g for 25 minutes at 18 degrees Celsius. Finally, with a transfer pipette, retrieve the interphase and transfer it to a 15-milliliter conical tube. Wash the cells with 10 milliliters of PBS, then centrifuge the cells at 220 g for five minutes at five degrees Celsius before further experimentation.The purification of the extracted microglial cells yielded up to 99%cell yield as confirmed by FACS staining. Double positive cells with an average size of 10 micrometers consistent with nonactivated microglia were observed.