Commencez par fixer un séparateur magnétique sur son support. Connectez une colonne de sélection au séparateur magnétique et placez un tamis cellulaire de 70 microns sur le dessus de la colonne de sélection. Placez un tube de 50 millilitres sous la colonne de sélection pour recueillir le débit.
Une fois que les cellules cérébrales de la souris ont atteint 80 % de confluence, aspirez le milieu et rincez les cellules avec du PBS. Ajoutez 0,25 % de trypsine pour détacher les cellules d’adhérence et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite un tampon d’arrêt.
Centrifuger la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes et retirer le surnageant. Pour la coloration des anticorps, remettre en suspension 10 à 7 cellules dans 100 microlitres de PBS. Ajoutez ensuite 10 microlitres de solution d’anticorps LYVE-1 et mélangez soigneusement.
Incubez le mélange pendant 30 minutes à l’obscurité à quatre degrés Celsius. Après incubation, centrifugez les cellules et jetez le surnageant. Rincez ensuite les cellules en ajoutant un millilitre de PBS et en centrifugeant à 300 G pendant cinq minutes.
Pour l’étiquetage des microbilles, remettre le granulé en suspension dans 100 microlitres de PBS et 20 microlitres de microbilles. Faire gonfler et incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Ensuite, centrifugez la suspension et lavez le granulé avec un millilitre de PBS.
Encore une fois, centrifugez et remettez en suspension la pastille dans quatre millilitres de PBS pour l’exclusion magnétique négative. Passez la suspension cellulaire à travers une passoire de 70 microns pour éliminer les grumeaux. Préparez la colonne de sélection en la rinçant avec trois millilitres de PBS.
Ajoutez ensuite une suspension de cellule dans la colonne de sélection. Lavez la colonne avec trois millilitres de PBS et collectez les cellules négatives LYVE-1 dans un tube de 50 millilitres. Pour la sélection magnétique positive, pipetez six millilitres de PBS dans la colonne de sélection.
Rincez ensuite les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne de sélection pour obtenir des LLEC positifs LYVE-1. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire positive et retirez le surnageant. Plaquer 10 à la cinquième cellule par centimètre carré dans une fiole T25 avec cinq millilitres de milieu de culture.
Maintenir la culture en remplaçant 50 % du milieu tous les deux jours. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, détachez-les comme démontré précédemment avant d’effectuer le passage cellulaire. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que le pourcentage de cellules positives pour LYVE-1 dans le deuxième passage n’était pas significativement différent de celui du troisième passage après MACS, ce qui indique une pureté supérieure à 95 %.
Les cellules positives à LYVE-1 n’exprimaient pas F48 et le facteur de croissance bêta dérivé des plaquettes, ce qui distinguait efficacement les LLEC des macrophages et des fibroblastes. Les cellules leptoméningées avant MACS présentaient une morphologie hétérogène allant de sphères rondes à des formes de fibres fusionnées. Cependant, après MACS, les LLEC présentaient des caractéristiques typiques de type endothélial, telles que des formes fusiformes et pavées.
