L’étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81960226, 81760223), de la Fondation des sciences naturelles de la province du Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) et de la Fondation de recherche scientifique du Département de l’éducation de la province du Yunnan (2023Y0784).

Cette recherche a reçu l’approbation du Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de médecine de Kunming (kmmu20220945). Toutes les expériences ont respecté les lignes directrices établies en matière de soins aux animaux. Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) ont été prélevées sur des souris mâles C57Bl/6J âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 20 et 25 g. Ces souris ont été achetées à l’Université de médecine de Kunming, en Chine. L’ensemble de la procédure expérimentale s’est déroulé dans des conditions stériles strictes. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire.
1. Préparation des réactifs et des instruments
REMARQUE : Toutes les étapes impliquant des solutions doivent être effectuées à l’intérieur d’une armoire à risques biologiques de classe II.
<ol><li>Préparez le tampon de lavage en mélangeant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec du calcium et du magnésium, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S) (voir le tableau des matériaux). Conservez ce tampon au froid à 4 °C. Il est indispensable de le préparer frais le jour de l’utilisation et de dégazer le tampon.</li>
	<li>Préparez les enzymes digestives en combinant 10 mL de PBS (sans calcium ni magnésium) avec 2 mL de trypsine à 0,25 %, 1 mL de papaïne à 20 mg/mL et 200 μL de collagénase I à 1 mg/mL (voir le tableau des matériaux). NOTA : S’assurer d’utiliser des aliquotes de volumes appropriés pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Conserver ces aliquotes à -20 °C.</li>
	<li>Préparez le milieu de culture à l’aide de la trousse de milieu de croissance de cellules endothéliales disponible dans le commerce, qui comprend le VEGF-C (100 ng/mL) et 1 % de P/S (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Préparez le tampon d’arrêt en complétant le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de FBS pour arrêter le processus de digestion.</li>
	<li>Préparez des instruments chirurgicaux stériles : ces instruments doivent inclure des ciseaux, une pince à épiler à pointe dentelée et une pince à épiler à pointe fine.</li>
</ol>2. Revêtement de flacon
<ol><li>Enduire le flacon T25 d’une solution de fibronectine à 100 μg/mL (voir tableau des matériaux) et incuber toute la nuit à 37 °C. Avant utilisation, retirez la solution de revêtement à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Lavez le flacon trois fois avec du PBS, aspirez ensuite le PBS et laissez le flacon T25 sécher à l’air libre.</li>
</ol>3. Dissociation des leptoméninges
REMARQUE : Utilisez toujours des tampons et des solutions pré-refroidis à 4 °C.
<ol><li>Anesthésiez les souris avec une inhalation excessive de 4% d’isoflurane, puis sacrifiez-les par décapitation rapide à l’aide de ciseaux préalablement nettoyés avec de l’éthanol à 70%.</li>
	<li>Incisez soigneusement la peau le long de la ligne médiane, en commençant par l’ouverture à l’arrière du crâne et en s’étendant vers la zone frontale.</li>
	<li>Retirez délicatement le crâne, en le soulevant doucement avec les ciseaux pour éviter d’endommager les leptoméninges, en veillant à ce que tout le cerveau, y compris les leptoméninges, soit obtenu.</li>
	<li>Plongez tout le cerveau dans un tampon de lavage et rincez-le doucement pour éliminer le sang de surface.</li>
	<li>Transférez le cerveau dans une boîte de Pétri stérile sans le hacher et extrayez les leptoméninges de la surface du cerveau à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine sous un microscope.</li>
	<li>Coupez le tissu leptoméninges en fragments à l’aide de micro-ciseaux stériles.</li>
</ol>4. Digestion enzymatique des leptoméninges
<ol><li>Ajouter 10 mL du mélange enzymatique (étape 1.2) aux fragments et incuber à 37 °C pendant 15 min. Agitez doucement pour vous assurer que les fragments se détachent du fond du tube. Ensuite, ajoutez 10 mL de tampon d’arrêt (étape 1.4) pour arrêter la digestion.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de PBS froid et passer le mélange à travers une passoire de 70 μm dans un tube stérile de 50 mL pour filtrer les grumeaux.</li>
</ol>5. Expansion cellulaire
<ol><li>Plaquer 1 x 10 5 cellules par cm 2 dans un flacon T25 enrobé de fibronectine (étape2) avec5 mL de milieu de culture.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h. Ensuite, retirez le milieu pour éliminer les cellules non attachées.</li>
	<li>Maintenir la culture en remplaçant 50 % du milieu tous les deux jours. Répétez ce processus deux ou trois fois.</li>
</ol>6. Sélection des cellules magnétiques
REMARQUE : Travaillez rapidement, maintenez la froideur des cellules et utilisez des solutions pré-refroidies pour éviter le marquage non spécifique des cellules.
<ol><li>Préparation des instruments et des réactifs : fixer un séparateur magnétique sur un support de séparateur magnétique (voir tableau des matériaux). Connectez une colonne de sélection au séparateur magnétique et positionnez une crépine de cellules de 70 μm au sommet de la colonne de sélection. Placez un tube de 50 ml sous la colonne de sélection pour recueillir le débit.</li>
	<li>Digestion enzymatique : une fois que les cellules ont atteint 80 % de confluence, aspirez le milieu et rincez les cellules avec du PBS. Ajouter 0,25 % de trypsine pour détacher les cellules adhérentes et incuber à 37 °C pendant 5 min. Arrêtez la digestion en ajoutant le tampon d’arrêt. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant.</li>
	<li>Incubation des anticorps : remettre en suspension 1 x 107 cellules au total dans 100 μL de PBS et ajouter 10 μL d’anticorps LYVE-1 (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger et incuber pendant 30 min à l’obscurité à 4 °C.<ol><li>Essorer les cellules à 300 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Rincez les cellules en introduisant 1 mL de PBS et en centrifugeant à 300 x g pendant 5 min. Retirez complètement le surnageant.</li>
	</ol></li>
	<li>Marquage des microbilles : remettre les cellules en suspension dans 100 μL de PBS et ajouter 20 μL de microbilles (voir le tableau des matériaux). Bien mélanger et incuber pendant 30 min à l’obscurité à 4 °C.<ol><li>Essorer les cellules à 300 x g pendant 5 min et décanter le surnageant. Ensuite, nettoyez les cellules avec 1 mL de PBS par centrifugation à 300 x g pendant 5 min. Enfin, retirez complètement le surnageant.</li>
	</ol></li>
	<li>Exclusion magnétique négative : remettre les cellules en suspension dans 4 mL de PBS. Passez les cellules à travers une crépine de 70 μm pour éliminer les grumeaux. Préparez la colonne de sélection (voir Tableau des matériaux) en la rinçant avec 3 mL de PBS, puis appliquez la suspension cellulaire dans la colonne de sélection.<ol><li>Effectuez les étapes de lavage avec 3 mL de PBS et collectez les cellules LYVE-1-négatives dans un tube de 50 mL positionné sous la colonne de sélection pour les laisser passer.</li>
	</ol></li>
	<li>Sélection magnétique positive : pipeter 6 mL de PBS dans la colonne de sélection. Rincez instantanément les cellules marquées magnétiquement en poussant fermement le piston dans la colonne de sélection pour obtenir des LLEC LYVE-1-positifs. REMARQUE : Attendez toujours que le réservoir de la colonne de sélection soit vide avant de passer à l’étape suivante.</li>
</ol>7. La culture des LLEC
<ol><li>Centrifuger les LLEC LYVE-1-positives à 300 x g pendant 5 min, puis retirer délicatement le surnageant.</li>
	<li>Plaquer 1 x 10 5 cellules par cm2 dans un flacon T25 enrobé de fibronectine avec5 mL de milieu de culture.</li>
	<li>Entretenez la culture en remplaçant 50 % du support tous les deux jours. Lorsque les cellules atteignent 80 % de confluence, détachez les cellules avec 0,25 % de trypsine et effectuez le passage cellulaire. Utilisez les cellules pour les expériences suivantes après 2-3 passages.</li>
</ol>8. Analyse par cytométrie en flux
REMARQUE : L’analyse par cytométrie en flux a été effectuée selon la procédure décrite précédemment15.
<ol><li>Ajouter 0,25 % de trypsine pour détacher les cellules adhérentes et incuber à 37 °C pendant 5 min. Ensuite, ajoutez le tampon d’arrêt pour arrêter la digestion.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min et aspirer complètement le surnageant. Remettre en suspension 1 x 106 cellules dans 100 μL de PBS.</li>
	<li>Ajouter 1 μL d’anticorps LYVE-1. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à l’obscurité à température ambiante.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans une quantité appropriée de tampon PBS pour analyse à l’aide de la cytométrie en flux et du logiciel FlowJo (voir le tableau des matériaux).</li>
</ol>9. Coloration immunofluorescente
REMARQUE : La coloration par immunofluorescence a été effectuée selon la procédure décrite précédemment16.
<ol><li>Lavez les cellules avec du PBS trois fois. Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min à température ambiante. Jetez le PFA et lavez les cellules avec du PBS trois fois.</li>
	<li>Appliquer le tampon de bloc pendant 1 h à température ambiante. Retirez le tampon de bloc des lamelles.</li>
	<li>Ajouter l’anticorps LYVE-1 dans le tampon de coloration aux cellules et incuber dans l’obscurité. Lavez les cellules trois fois avec du PBS.</li>
	<li>Ajouter un anticorps secondaire approprié (voir le tableau des matériaux) dans le tampon de coloration aux cellules et incuber dans l’obscurité. Lavez les cellules trois fois avec du PBS.</li>
	<li>Contre-coloration avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Les cellules sont maintenant prêtes pour la microscopie d’immunofluorescence.</li>
</ol>

Etablissement de cultures LLEC in vitro à l’aide de la sélection cellulaire magnétique

<ol>
	<li>Shibata-Germanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+conservation+of+non-lumenized+lymphatic+endothelial+cells+in+the+mammalian+leptomeninges.">Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges.</a> Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).</li><li>Su&#225;rez, I., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+with+many+talents:+lymphatic+endothelial+cells+in+the+brain+meninges.">Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges.</a> Cells. 10 (4), 799 (2021).</li><li>Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+purifies+murine+lymph+node+lymphatic+endothelium.">Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).</li><li>Jones, B. E., Yong, L. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culturing+of+primary+lymphatic+endothelial+cells+from+collecting+lymphatics:+A+techniques+study.">Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study.</a> Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).</li><li>Lapinski, P. E., King, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+lymphatic+endothelial+cells+from+lung+tissue.">Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).</li><li>Lokmic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Identification,+and+culture+of+human+lymphatic+endothelial+cells.">Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).</li><li>Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry-based+isolation+of+dermal+lymphatic+endothelial+cells+from+newborn+rats.">Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats.</a> Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+endothelial+cells+by+multi-parameter+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).</li><li>Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+functional+characterization+of+rat+arachnoid+cell+lines.">Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines.</a> Neuroscience. 177, 23-34 (2011).</li><li>Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+preliminary+characterization+of+immortalized+cell+line+derived+from+rat+lymphatic+capillaries.">Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries.</a> Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).</li><li>Park, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+culture+and+study+of+adult+human+brain+cells+from+neurosurgical+specimens.">Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens.</a> Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).</li><li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lyve1+expression+reveals+novel+lymphatic+vessels+and+new+mechanisms+for+lymphatic+vessel+development+in+zebrafish.">lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish.</a> Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).</li><li>Bokobza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Isolation+of+microglial+cells+from+neonate+mouse+for+primary+cell+cultures.">Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).</li><li>Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+mouse+aortic+endothelial+cells.">Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Petrova, T. V., Koh, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+lymphatic+vasculature:+From+development+to+pathophysiology.">Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).</li><li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues.">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+heparan+sulfate+deficiency+results+in+altered+growth+responses+to+vascular+endothelial+growth+factor-C+(VEGF-C).">Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C).</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).</li><li>DeSisto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analyses+of+the+developing+meninges+reveal+meningeal+fibroblast+diversity+and+function.">Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function.</a> Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+eliminating+fibroblast+contamination+in+mouse+and+human+primary+corneal+epithelial+cell+cultures.">A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures.</a> Current Eye Research. , 1-11 (2023).</li><li>Starzonek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+human+dermal+stem+cells+from+primary+cell+cultures+through+the+elimination+of+fibroblasts.">Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts.</a> Cells. 12 (6), 949 (2023).</li><li>Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fibroblast+on+the+arachnoid+leptomeningeal+cells+in+vitro.">The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro.</a> Brain Research. 1657, 109-119 (2017).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le protocole actuel pour la récolte et la culture in vitro des LLEC n’a pas encore été rapporté. Cette étude présente un protocole multiprocédural reproductible pour la récolte et la culture des LLEC à partir de leptoméninges de souris.
Bien que ce protocole multiprocédural soit reproductible, il y a plusieurs considérations clés. Par exemple, les flacons T25 enrobés de fibronectine favorisent l’adhésion des LLEC et leur fonction en éliminant les cellules non adhé...

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) nouvellement découvertes forment un maillage de cellules individuelles à l’intérieur des leptoméninges, présentant un modèle de distribution distinct par rapport aux cellules endothéliales lymphatiques périphériques 1,2. Les fonctions cellulaires et les implications cliniques associées aux LLEC restent en grande partie un territoire inexploré. Afin d’ouvrir la voie à la recherche fonctionnelle sur les LLECs, il est impératif d’établir un modèle in vitro pour leur étude. Par conséquent, cette étude a mis au point un protocole complet pour l’isolement et la culture primaire des LLECs.
Les souris sont le modèle animal préféré en raison de leur aptitude à la manipulation génétique dans la recherche sur les maladies. Des études antérieures ont réussi à isoler des cellules endothéliales lymphatiques de divers tissus de souris, notamment les ganglions lymphatiques3, le tissu mésentérique4, le tissu dermique5, les lymphatiques collecteurs6 et le tissu pulmonaire7. Ces procédures d’isolement se sont principalement appuyées sur des techniques telles que le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS) et le tri par cytométrie en flux 8,9,10. De plus, les efforts de recherche ont conduit à l’établissement de lignées cellulaires arachnoïdiennes de rat et de lignées cellulaires capillaires lymphatiques de rat11,12. Malgré l’existence de techniques de culture d’explants pour les leptoméninges13, il existe un besoin urgent d’un protocole normalisé pour l’isolement et la culture des LLECs. Par conséquent, cette étude a permis de récolter et de cultiver avec succès des LLEC en dissociant méticuleusement les leptoméninges sous la direction d’un microscope et en favorisant l’expansion des LLEC grâce à l’utilisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-C (VEGF-C). Le marqueur distinctif des cellules endothéliales lymphatiques est le récepteur hyaluronique du vaisseau lymphatique-1 (LYVE-1)14. Ce protocole en plusieurs étapes isole sélectivement les LLEC LYVE-1-positives à l’aide de MACS et vérifie ensuite leur pureté par analyse cytométrique en flux et coloration immunofluorescente.
Les principales étapes de ce protocole en plusieurs étapes peuvent être résumées comme suit : enrobage du flacon, dissociation des leptoméninges, digestion enzymatique des leptoméninges, expansion cellulaire, sélection magnétique des cellules et culture ultérieure des LLECs. Enfin, la pureté des LLEC isolées est confirmée par analyse cytométrique en flux et coloration immunofluorescente. L’objectif principal de cette étude est de présenter un protocole reproductible en plusieurs étapes pour l’isolement des LLEC à partir de leptoméninges de souris et leur culture in vitro ultérieure. Ce protocole est sur le point de faciliter grandement les recherches sur les fonctions cellulaires et les implications cliniques des LLECs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Block buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0102</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C8140</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>11995</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1041</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>C-3202</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S9010</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8180&#160;</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V10.8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LYVE-1 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0443-82</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separator stand</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P/S</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8430-25g</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D1040</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDPN antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-53533</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-81983</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection column&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Sterile before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51947</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFR-3 antibody</td>
			<td>Santa</td>
			<td>sc-514825</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvest and primary culture of leptomeningeal lymphatic endothelial cells

Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs) sont une population cellulaire intracrânienne récemment découverte avec une distribution unique clairement distincte des cellules endothéliales lymphatiques périphériques. Leur fonction cellulaire et leurs implications cliniques restent largement inconnues. Par conséquent, la disponibilité d’un approvisionnement en LLEC est essentielle pour mener une recherche fonctionnelle in vitro. Cependant, il n’existe actuellement aucun protocole pour la récolte et la culture des LLEC in vitro.
Cette étude a permis de récolter avec succès les LLEC à l’aide d’un protocole en plusieurs étapes, qui comprenait l’enrobage de la fiole de fibronectine, la dissection des leptoméninges à l’aide d’un microscope, la digestion enzymatique des leptoméninges pour préparer une suspension unicellulaire, l’induction de l’expansion des LLEC avec le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire-C (VEGF-C) et la sélection des cellules positives du récepteur hyaluronique des vaisseaux lymphatiques-1 (LYVE-1) par tri cellulaire activé magnétiquement (MACS). Ce processus a finalement conduit à l’établissement d’une culture primaire. La pureté des LLEC a été confirmée par coloration par immunofluorescence et analyse par cytométrie en flux, avec un niveau de pureté supérieur à 95 %. Ce protocole en plusieurs étapes a démontré sa reproductibilité et sa faisabilité, ce qui facilitera grandement l’exploration de la fonction cellulaire et des implications cliniques des LLECs.

The newly discovered leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) form a meshwork of individual cells within the leptomeninges, exhibiting a distinct distribution pattern when compared to peripheral lymphatic endothelial cells1,2. The cellular functions and clinical implications associated with LLECs remain largely uncharted territory. In order to pave the way for functional research on LLECs, it is imperative to establish an in vitro model for their study. Therefore, this study has devised a comprehensive protocol for the isolation and primary culture of LLECs.
Mice are the preferred animal model due to their suitability for genetic manipulation in disease research. Previous studies have successfully isolated lymphatic endothelial cells from various mouse tissues, including lymph nodes3, mesenteric tissue4, dermal tissue5, collecting lymphatics6, and lung tissue7. These isolation procedures have primarily relied on techniques such as magnetic-activated cell sorting (MACS) and flow cytometry sorting8,9,10. Additionally, research efforts have led to the establishment of rat arachnoid cell lines and rat lymphatic capillary cell lines11,12. Despite the existence of explant culture techniques for leptomeninges13, there exists an urgent need for a standardized protocol for the isolation and culture of LLECs. Consequently, this study has successfully harvested and cultured LLECs by meticulously dissociating leptomeninges under the guidance of a microscope and promoting LLECs expansion through the use of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The distinctive marker for lymphatic endothelial cells is lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1)14. This multi-step protocol selectively isolates LYVE-1-positive LLECs using MACS and subsequently verifies their purity through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining.
The primary steps of this multi-step protocol can be summarized as follows: flask coating, dissociation of leptomeninges, enzymatic digestion of leptomeninges, cell expansion, magnetic cell selection, and subsequent culture of LLECs. Finally, the purity of the isolated LLECs is confirmed through flow cytometric analysis and immunofluorescent staining. The overarching aim of this study is to present a reproducible, multi-step protocol for the isolation of LLECs from mouse leptomeninges and their subsequent in vitro culture. This protocol is poised to greatly facilitate investigations into the cellular functions and clinical implications of LLECs.

Pleins feux sur l’auteur : Dévoilement des fonctions cellulaires et des implications cliniques potentielles des cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées 

Récolte et culture primaire de cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées

This protocol is designed for areas of by other researchers only interested where established the multi procedure to and cultural primary areas Our protocol ultimately led to the establishment of our primary culture of area CS with a purity level exceeding 95%There is currently no existing protocol for harvesting and culturing Our results paved the way for further investigating the similar function of LLECS in virtual. At RUC, our recent discovery intracranial cellular population, the biological significance of RUC We will conduct further research on the cellular function and review its clinical implication.

Cette étude présente un protocole reproductible en plusieurs étapes pour le prélèvement de cellules endothéliales lymphatiques (LLECs) chez la souris et l’établissement ultérieur de leur culture primaire in vitro. Les étapes clés comprennent la préparation du flacon et l’enrobage de la fibronectine, la dissociation des leptoméninges, l’obtention d’une suspension unicellulaire par digestion enzymatique et l’induction de l’expansion des LLEC avec le VEGF-C. Les LLEC LYVE-1-positives sont en...

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Les cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées (LLECs), un type de cellules intracrâniennes récemment identifiées, ont des fonctions mal comprises. Cette étude présente un protocole reproductible pour la récolte de LLEC à partir de souris et l’établissement de cultures primaires in vitro . Ce protocole est conçu pour permettre aux chercheurs de se plonger dans les fonctions cellulaires et les implications cliniques potentielles des LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

Ce protocole est conçu pour les zones de par d’autres chercheurs uniquement intéressés là où a établi la procédure multi et les zones primaires culturelles Notre protocole a finalement conduit à l’établissement de notre culture primaire de la zone CS avec un niveau de pureté supérieur à 95%Il n’existe actuellement aucun protocole existant pour la récolte et la culture Nos résultats ont ouvert la voie à une étude plus approfondie de la fonction similaire de LLECS dans le virtuel. À RUC, notre récente découverte de la population cellulaire intracrânienne, la signification biologique de RUC Nous mènerons d’autres recherches sur la fonction cellulaire et examinerons son implication clinique.

harvest-primary-culture-leptomeningeal-lymphatic-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

871 vues.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. Ce protocole est conçu pour les zones de par d’autres chercheurs uniquement intéressés là où a établi la procédure multi et les zones primaires culturelles Notre protocole a finalement conduit à l’établissement de notre culture primaire de la zone CS avec un niveau de pureté supérieur à 95%Il n’existe actuellement aucun protocole existant pour la récolte et la culture Nos résultats ont ouvert la voie à une étude plus approfondie de la fonction similaire de LLECS dans le ...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Dévoilement des fonctions cellulaires et des implications cliniques potentielles des cellules endothéliales lymphatiques leptoméningées 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

Recherche

Neurosciences

Mouse Leptomeninges Dissociation and Enzymatic Digestion for Efficient Culturing of Leptomeningeal Cells

To begin, carefully incise the skin of the sacrificed mouse, starting from the skull's opening and extending towards the frontal area. Using scissors, delicately lift and remove the skull without damaging the leptomeninges, collecting the entire brain. Submerge the whole brain in the washing buffer, and gently flush it to remove surface blood.Transfer the brain into a sterile Petri dish without chopping. Then, under a microscope, use fine-point tweezers to extract the leptomeninges from the brain's surface. Using sterile microscissors, cut the leptomeninges tissue into fragments.Repair the digestive enzyme mix using the given components. Add 10 milliliters of mix to the fragments and incubate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Gently agitate to detach the fragments from the bottom of the tube.Then, add 10 milliliters of stopping buffer. Centrifuge the suspension at 300 g for five minutes at four degrees Celsius. And using a pipette, carefully remove the supernatant.Add 10 milliliters of cold PBS, and filter any clumps through a 70 micron strainer into a sterile 50 milliliter tube. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a fibronectin-coated T25 flask with five milliliters of culture medium, and incubate at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for 24 hours. After incubation, replace the medium with a fresh medium to eliminate non-attached cells.

Dissociation des leptoméninges de souris et digestion enzymatique pour une culture efficace des cellules leptoméningées

Establishing Primary In Vitro Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells (LLECs)

Begin by attaching a magnetic separator to its stand. Connect a selection column to the magnetic separator and place a 70 micron cell strainer on top of the selection column. Place a 50 milliliter tube beneath the selection column to collect the flow.Once the mouse brain cells reach 80%confluency, aspirate the medium and rinse the cells with PBS. Add 0.25%trypsin to detach the adherence cells and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes. Then add a stopping buffer.Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes, and remove the supernatant. For antibody staining, resuspend 10 to the seven cells in 100 microliters of PBS. Then add 10 microliters of LYVE-1 antibody solution and mix thoroughly.Incubate the mixture for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. After incubation, centrifuge the cells and discard the supernatant. Then rinse the cells by adding one milliliter of PBS and centrifuging at 300 G for five minutes.For microbead labeling, resuspend the pellet in 100 microliters of PBS and 20 microliters of microbeads. Make swell and incubate for 30 minutes in the dark at four degrees Celsius. Then centrifuge the suspension and wash the pellet with one milliliter of PBS.Again, centrifuge and resuspend the pellet in four milliliters of PBS for magnetic negative exclusion. Pass the cell suspension through a 70 micron strainer to eliminate clumps. Prepare the selection column by rinsing it with three milliliters of PBS.Then add cell suspension into the selection column. Wash the column with three milliliters of PBS and collect LYVE-1 negative cells into a 50 milliliter tube. For magnetic positive selection, pipette six milliliters of PBS into the selection column.Then flush the magnetically labeled cells by firmly pushing the plunger into the selection column to obtain LYVE-1 positive LLECs. Next, centrifuge the positive cell suspension and remove the supernatant. Plate 10 to the fifth cells per square centimeter into a T25 flask with five milliliters of culture medium.Maintain the culture by replacing 50%of the medium every alternate day. When the cells reach 80%confluency, detach them as demonstrated previously before performing cell passage. Flow cytometry analysis revealed that the percentage of LYVE-1 positive cells in passage two was not significantly different from passage three after MACS, indicating a purity greater than 95%Immunofluorescent staining confirmed co-staining of LYVE-1 with PDPN, VEGFR-3 and PROX1, establishing the identity of LLECs.LYVE-1 positive cells did not express F48 and platelet derived growth factor beta, effectively distinguishing LLECs from macrophages and fibroblasts. Leptomeningeal cells before MACS displayed heterogeneous morphology ranging from round spheres to fused fiber shapes. However, post MACS, LLECs exhibited typical endothelial-like features such as spindle and cobblestone shapes.