Commencez par diluer 0,5 microlitre des cultures nocturnes d’Agrobacterium tumefaciens avec 50 millilitres d’eau ultrapure autoclave. Étalez 10 microlitres de cette culture diluée sur un bouillon de lysogénie ou une assiette LB. Incuber l’assiette à 28 à 30 degrés Celsius pendant un à trois jours.
Maintenant, inoculez une seule colonie dans 20 millilitres de milieu LB complété par de la rifampicine. Incubez la culture pendant la nuit à 28 à 30 degrés Celsius. Le lendemain, inoculez 500 millilitres de milieu LB ordinaire dans un flacon shaker avec neuf millilitres de culture de nuit.
Placez les cultures sur un shaker à 28 à 30 degrés Celsius. Après l’incubation et la division des cultures en tubes, centrifugez les tubes réfrigérés à quatre degrés Celsius et à 4 000 g pendant 15 minutes. À l’aide d’une pipette, retirer le surnageant et remettre en suspension chaque pastille dans 50 millilitres d’eau glacée.
Après avoir centrifugé et éliminé le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 25 millilitres d’eau glacée dans chaque tube. Centrifugez comme précédemment, puis remettez en suspension la pastille dans un millilitre de glycérol glacé à 10%. Maintenant, combinez le contenu de tous les tubes dans un seul tube de 50 millilitres avant de centrifuger.
Enfin, après avoir jeté le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 400 microlitres de glycérol glacé.
