Commencez par pipeter 0,5 millilitre d’une culture en phase logarithmique de chlorella vulgaris. Étalez la culture sur une plaque de tris-acétate-phosphate ou de gélose TAP. Cultivez la culture pendant cinq jours à 25 degrés Celsius.
Ensuite, inoculez 10 millilitres de bouillon LB supplémenté avec une boucle pleine de culture d’agrobacterium tumefaciens électroporée dans un flacon shaker. Incuber le ballon à une température de 28 à 30 degrés Celsius et à 250 tr/min pendant la nuit. Le lendemain, inoculez un millilitre de la culture de nuit dans 50 millilitres de LB supplémenté. Incuber le flacon à 28 à 30 degrés Celsius et 250 tr/min.
Co-cultiver les cultures d’algues et de bactéries. Tout d’abord, transférez la culture d’agrobactérie dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger le tube à 4 000 G pendant 30 minutes à température ambiante.
Ensuite, pipetez le surnageant pour le jeter et lavez les cellules deux fois à l’aide du milieu d’induction. Ensuite, ajoutez 25 millilitres de milieu d’induction sur la plaque de culture de Chlorella Vulgaris. Transvaser les cellules dans un tube de 50 millilitres, puis centrifuger à 4 000 G pendant 15 minutes à température ambiante.
Après avoir éliminé le surnageant, combinez la pastille de cellules d’algues avec 200 microlitres de suspension bactérienne. Agiter la culture combinée dans un incubateur rotatif à une température de 21 à 25 degrés Celsius, c’est-à-dire à 150 tr/min pendant une heure. Étalez 200 microlitres de culture mixte sur des plaques de milieu d’induction, complétées par 15 millimoles de glucose et incubez les plaques dans l’obscurité à 21 à 25 degrés Celsius pendant trois jours.
Au bout de trois jours, prélevez les microalgues dans une fiole à l’aide de 10 millilitres de média TAP. Complété par 20 milligrammes par litre de tétracycline. Incubez le flacon dans l’obscurité pendant deux jours, en maintenant une température comprise entre 21 et 25 degrés Celsius.
Plaquer 500 microlitres de culture sur un milieu sélectif complété par 20 milligrammes par litre de tétracycline. Incubez les plaques à une température de 21 à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant deux jours, avant de les déplacer dans une chambre éclairée. Sélectionnez des colonies individuelles dans la plaque de transformation et étalez-les sur des plaques de gélose TAP.
Pour effectuer la PCR de la colonie, commencez par ajouter un petit volume de cellules d’algues transformantes à 10 microlitres d’eau stérile. Faites bouillir la solution à 98 degrés Celsius pendant 15 minutes. De même, traiter un autre modèle de PCR pour confirmer l’absence d’agrobactérie dans l’échantillon.
Effectuez les prélèvements PCR sur un gel d’ADN d’agarose à l’aide d’une échelle, afin de vérifier la taille des fragments obtenus. Les colonies transformées ont pu se développer sur des plaques contenant de l’hygromycine avec du céfotaxime. Les colonies de type sauvage ne se sont pas développées sur les assiettes.
Des colonies résistantes jusqu’à 70 milligrammes par litre de céfotaxime ont été obtenues. L’amplicon PCR de la colonie de pCAMBIA1302 était absent dans les échantillons d’algues. Cependant, le MGFP5G dans l’amplicon a été détecté dans les trois échantillons d’algues.
Les cultures d’algues qui étaient à plusieurs reprises des sous-cultures de Cefotaxime ont montré l’absence de la protéine de virulence E2, indiquant l’absence de plasmide. Une différence significative dans la croissance des algues entre les transformants et les souches de type sauvage a été observée. Malgré une croissance plus faible, le transformant avait des niveaux de fluorescence plus élevés lorsqu’il était normalisé pour la densité cellulaire.
