Pour commencer, rincez la chambre supérieure des plaques à 24 puits avec du PBS. Mélangez les cellules BEND3 avec le milieu DMEM à l’aide d’un mélangeur vortex pour obtenir une suspension. Ensuite, semez 200 microlitres de suspension cellulaire BEND3 sur la membrane PET dans la chambre supérieure d’une plaque à 24 puits.
Ajouter 1 200 microlitres de milieu complet dans la chambre inférieure de la plaque pour stabiliser la pression osmotique des chambres supérieure et inférieure. Changez le milieu en retirant lentement l’ancien milieu d’un côté avec une pipette à pression négative et en ajoutant un nouveau milieu le long de la paroi pendant l’échange de fluide. Avant de mesurer le TEER, placez la résistance, la solution d’hypochlorite de sodium à 5 %, l’éthanol à 75 % et l’eau doublement distillée sur une table ultra propre.
Allumez l’irradiation UV pendant 30 minutes pour éliminer les bactéries résiduelles et les agents pathogènes. Placez les électrodes dans une solution d’hypochlorite de sodium à 5 % en agitant lentement pendant trois à cinq secondes. Plongez ensuite dans de l’éthanol à 75% pendant 15 minutes.
Enfin, transférez dans du PBS ou de l’eau doublement distillée jusqu’à utilisation. Ensuite, allumez l’interrupteur situé à l’arrière du compteur de résistances de cellule. Cliquez sur Sélectionner une plaque et sélectionnez une plaque à 24 puits.
En fonction de l’opération, sélectionnez la séquence de détection appropriée. Insérez une résistance d’un kilo ohm dans la prise droite pour calibrer l’instrument. Si le résultat de l’étalonnage est de 1000 plus moins 5 ohms, considérez que l’instrument est précis.
Si ce n’est pas le cas, cliquez sur Mode Units sur l’interface principale pour sélectionner Ohms, puis cliquez sur Calibrer. Ensuite, retirez la résistance kilo ohm et remplacez-la par l’électrode de mesure à l’aide d’un fil de connexion. Placez l’électrode verticalement dans la plaque à 24 puits contenant uniquement du milieu et cliquez sur Blank Handling (Manipulation des blancs) sur l’instrument.
La valeur de fond de la résistance de la plaque sans cellules assises doit être d’environ 134,4 ohms. Ensuite, insérez les deux électrodes dans les chambres supérieure et inférieure de la plaque assise, de sorte que la couche cellulaire se trouve entre elles. Enregistrez la valeur de la résistance en appuyant doucement sur la pédale.
Assurez-vous que l’électrode ne touche pas les cellules de la chambre supérieure et du fond de la chambre inférieure. Obtenez les valeurs TEER en multipliant les valeurs de résistance électrique par la zone inférieure de la chambre supérieure, comme indiqué dans l’équation. Tracez un tracé linéaire de TEER en fonction du temps en jours.
Lorsque la valeur de résistance n’augmente pas avec le temps, les cellules ont formé une barrière. Les valeurs de résistance tracées en fonction du temps pour les cellules BEND3 ont montré que les valeurs TEER des cellules ont commencé à se stabiliser le cinquième jour.
