Pour commencer, transfectez les cellules d’adénocarcinome de l’estomac avec TMEM200A d’ARN-Si et incubez pendant deux jours. Ensuite, jetez le milieu de culture cellulaire des puits et lavez doucement les cellules deux fois avec un millilitre de PBS. Placez les cellules sur de la glace et ajoutez 150 microlitres de tampon de lyse de test de précipitation radio-immune pré-refroidi.
À l’aide d’un grattoir à cellules en plastique, détachez soigneusement les cellules adhérentes de la boîte et transférez doucement la solution cellulaire dans un tube de microcentrifugation pré-refroidi. Ensuite, centrifugez le lysat cellulaire à 1,5 par 10 élevé à la puissance quatre G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, et transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. À l’aide d’une trousse d’analyse des protéines BCA, déterminez la teneur en protéines en suivant les instructions du fabricant.
Chargez 30 grammes de protéines de chaque échantillon sur un gel SDS-PAGE à 10 %. Faites fonctionner le gel à 80 volts pendant 0,5 heure, suivi de 1,5 heure à 120 volts. Ensuite, transférez les protéines du gel sur une membrane PVDF de 45 micromètres à un courant constant de 300 milliampères pendant 1 à 1,5 heure.
Placez la membrane PVDF sur un shaker pendant trois cycles de cinq minutes chacun. Après avoir agité, ajoutez TBST dans le récipient avec le côté protéique vers le haut. Placez la membrane dans le tampon de blocage pendant 30 minutes à température ambiante.
Lavez la membrane avec TBST pendant trois cycles de 10 minutes chacun. Incuber la membrane avec les anticorps primaires pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé la membrane trois fois avec TBST, ajoutez un anticorps secondaire de lapin ou de souris et incubez pendant une heure à température ambiante.
Ensuite, ajoutez un substrat ECL à la membrane PVDF pendant 30 secondes et détectez le signal à l’aide d’un système d’imagerie. L’efficacité de TMEM200A a été significativement réduite dans les cellules cancéreuses gastriques HGC-27 transfectées avec l’ARN-Si, par rapport aux cellules non transfectées. L’ARNi TMEM200A a inhibé de manière significative les protéines apparentées dans la transition mésenchymateuse épithéliale et a affecté la phosphorylation de l’AKT dans la voie de signalisation de la phosphoinositide 3-kinase.
