Pour commencer à utiliser une pipette sérologique, retirez le milieu de culture du flacon T75 contenant 70 % de culture confluente MDA-MB-231. Ajoutez trois millilitres de trypsine dans le flacon et incubez à 37 degrés avec 5% de dioxyde de carbone pendant trois à cinq minutes pour détacher les cellules du flacon. Ensuite, pour neutraliser la trypsine, ajoutez trois millilitres de DMEM dans le flacon.
Recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et essorer à 400 G pendant quatre minutes. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre la pastille en suspension dans deux millilitres de PBS. À l’aide d’un compteur de cellules, déterminez la concentration cellulaire.
Transférez huit fois 10 à la cinquième cellule dans un tube de 15 millilitres et ajoutez du PBS pour que le volume atteigne un millilitre. Ajoutez ensuite deux microlitres de CFSE dans le tube et mélangez soigneusement la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Placez le tube à 37 degrés Celsius et incubateur à 5% de dioxyde de carbone pendant 20 minutes.
Ensuite, ajoutez cinq millilitres de DMEM dans le tube et centrifugez pour agglomérer les cellules marquées CFSE. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de DMEM. Après avoir réévalué la concentration cellulaire, transférez quatre fois 10 aux cinquièmes cellules dans un réservoir de réactif de 25 millilitres.
Ajoutez du DMEM pour obtenir un volume de huit millilitres et mélangez la suspension cellulaire avec une pipette sérologique de cinq millilitres. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque rangée de la moitié gauche d’une plaque noire à 96 puits. De même, ajoutez la suspension de la cellule défonçable EGFR sur la moitié droite de la plaque.
Pour assurer une distribution uniforme des cellules, déplacez la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre sur la plate-forme. Incubez la plaque pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour que les cellules tumorales se fixent. Sur la base du nombre de cellules Jurkat non transduites et exprimant le CAR, transférez quatre fois 10 aux cinquièmes cellules CAR-J dans un réservoir de 25 millilitres.
Ajouter le DMEM dans le réservoir jusqu’à obtenir un volume final de deux millilitres. Pour un rapport effecteur/tumeur de 4 :1, ajoutez deux fois 10 aux quatrièmes cellules CAR-J par puits dans 100 microlitres de milieu le long du côté du puits sans perturber les cellules tumorales attachées. Ajoutez ensuite 100 microlitres de DMEM sur le côté des puits contenant des cellules tumorales et Jurkat pour obtenir 300 microlitres de volume par puits.
Déplacez la plaque comme démontré pour assurer une distribution uniforme des cellules de Jurkat sur les cellules tumorales. Laissez la co-culture s’établir à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures.
