Après avoir co-cultivé des jurkats exprimant le CAR avec des cellules tumorales marquées au CFSE, retournez doucement la plaque sur une serviette en papier et tapotez pour jeter les surnageants contenant du CAR-J. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 microlitres de milieu FluoroBrite DMEM contenant de l’iode propidium, ou PI, dans les puits sans perturber les cellules tumorales adhérentes. Ajoutez ensuite 20 microlitres de 20% de Triton X dans le premier puits de chaque type de tumeur, servant de contrôle total mort.
Incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 minutes avant l’imagerie. Après l’imagerie fluorescente, utilisez l’un des puits de cellules tumorales uniquement pour calibrer le canal fluorescent vert. Pour exclure les cellules au bord des puits, diminuez le masque du puits à 98 %Identifiez les cellules tumorales marquées CFSE sur le canal fluorescent vert et ajustez la valeur du seuil d’intensité de fluorescence pour capturer toutes les cellules du puits.
Réglez le diamètre minimum de la cellule à 25 micromètres pour exclure les débris détectés dans le canal CFSE. Activez ensuite les objets tactiles séparés pour identifier les cellules individuelles. Ensuite, définissez les portes pour définir les populations de cellules vivantes par rapport aux populations de cellules mortes.
Sélectionnez les cellules marquées CFSE et générez un histogramme des comptages sur l’axe des ordonnées en fonction de l’intensité IP moyenne sur l’axe des abscisses. Ajustez la valeur de l’axe des x pour mieux visualiser les cellules et dessinez un séparateur pour différencier les cellules colorées à faible PI des cellules colorées à IP élevé. Étiquetez les cellules colorées à faible PI comme des cellules vivantes.
Ensuite, définissez un autre histogramme sur les cellules vivantes avec une aire sur l’axe des x et des comptes sur l’axe des y. Étiquetez les cellules non défoncées comme de grosses cellules vivantes. Ensuite, prélevez un autre séparateur en utilisant uniquement la tumeur pour capturer les cellules et filtrer les débris.
Après avoir exécuté l’analyse sur l’ensemble de la plaque, exportez la feuille de calcul contenant les chiffres. Tracez le nombre de grosses cellules pour déterminer le nombre de cellules tumorales vivantes marquées CFSE restant dans le puits après l’exposition au CAR-J. Enfin, effectuez une analyse statistique à l’aide d’une ANOVA à un facteur.
La cytotoxicité de CAR-J1 a augmenté avec un rapport effecteur/tumeur plus élevé et plus de 50% de destruction a été observé à un rapport effecteur/tumeur de quatre pour un. Des constructions de CAR ciblant l’EGFR avec des domaines charnières modifiés ont montré une destruction spécifique de l’antigène contre les cellules exprimant MDA-MB-231 exprimant l’EGFR, et aucune destruction significative n’a été observée contre les cellules knock-out de l’EGFR. Des constructions CAR ont également été exprimées sur des lymphocytes T CD3 dérivés de PBMC.
Cependant, il n’y avait pas d’expression de l’EGFR-CAR contenant la charnière CD8. L’IgG courte a montré le moins de puissance cytotoxique contre les cellules MDA-MB-231 par rapport aux IgG longues et IgG moyennes.
