Dissociation des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines et détermination optimale de l’étape de cryoconservation

Pour commencer, diluez un flacon de matrice de membrane basale froide décongelée avec 12 millilitres de DM EM F12. Mélangez bien la suspension. Ajoutez une lamelle dans chaque puits d’une plaque de 24 puits.

Ensuite, pipetez 250 microlitres de la solution de matrice diluée dans chaque puits. Jeter le milieu de culture des plaques de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de CSEh cultivées. Lavez les plaques deux fois avec un millilitre de PBS préchauffé par puits.

Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de réactif de dissociation cellulaire dans les puits des plaques de culture et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour initier la digestion. Après l’incubation, observez les cellules au microscope pour confirmer la fin de la digestion. Maintenant, avec une pipette d’un millilitre, pipetez doucement la suspension cellulaire de haut en bas 10 fois.

Ajouter un milieu de culture préchauffé pour diluer la suspension. Ensuite, centrifugez-le à 250 G pendant trois minutes à température ambiante. Videz le surnageant du tube à centrifuger.

Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans deux millilitres de milieu de culture. À l’aide d’une pipette, mélangez les cellules 10 à 15 fois. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres.

Ensuite, comptez les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes. Aspirez la solution de revêtement avant le placage. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu de culture dans chaque puits et ensemencez les cellules sur les lamelles.

Après l’incorporation et la coloration de l’EDU, capturez les images de cinq champs aléatoires avec un microscope à fluorescence. Calculez le pourcentage de cellules EDU positives. Ensuite, tracez les courbes temporelles de proportion correspondantes pour générer une courbe de croissance.

Enfin, déterminez la fenêtre de congélation de la phase exponentielle pour chaque lignée cellulaire. Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes ont d’abord perdu leur morphologie hexagonale caractéristique, mais l’ont ensuite retrouvée dans la phase exponentielle de croissance. Lorsque les cellules ont été cultivées pendant une semaine supplémentaire, la prolifération cellulaire a diminué.

L’essai de prolifération de l’EDU a confirmé que les cellules P2 du cinquième jour présentaient un taux de prolifération plus élevé, tandis que les cellules P2 du 11e jour étaient entrées dans la phase de décélération.