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Préservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines avec cryoconservation optimisée

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November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200824-v

November 3rd, 2023

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Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* Ces auteurs ont contribué à parts égales

Transcription

Pour commencer, dissociez les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de CSEh, préparez la suspension cellulaire, puis comptez les cellules. Maintenant, centrifugez les cellules à 250 g pendant trois minutes à température ambiante. Versez le surnageant, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de cryoconservation.

Ensuite, transférez un millilitre de suspension cellulaire dans un flacon cryogénique de 1,2 millilitre. Placez les flacons cryogéniques dans un récipient de congélation et congelez-les pendant la nuit à moins 80 degrés Celsius. Transférez les flacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

Pour décongeler les flacons congelés, chauffez d’abord le milieu de culture dans des billes métalliques chauffées à 37 degrés Celsius, pré-remplissez 10 millilitres de milieu de culture réchauffé dans un tube de 15 millilitres. Maintenant, retirez les flacons cryogéniques de l’azote liquide et placez-les dans un système de décongélation automatisé pour une décongélation rapide. Déposer 0,5 à un millilitre du milieu de culture préchauffé dans le flacon cryogénique pour assurer une adaptation cellulaire progressive.

Ensuite, pipetez 1,5 à deux millilitres de la suspension cellulaire dans le tube de 15 millilitres avec un fluide. Centrifugez les cellules à 250 g pendant trois minutes à température ambiante. Ensuite, jetez le surnageant.

Remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu chaud. Chargez les cellules dans un hémocytomètre et comptez-les pour déterminer les taux de récupération et de survie. Cultivez les cellules décongelées sur des plaques recouvertes d’une membrane basale dans un milieu de culture avec Y27632.

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes qui ont été congelées le cinquième jour dans leur phase exponentielle ont montré un taux d’attachement plus élevé après la décongélation. Par rapport à leur morphologie hexagonale caractéristique, les cellules congelées à d’autres moments avaient un phénotype fibroblastique. Les cellules P2 du cinquième jour ont montré une expression plus élevée et des marqueurs cellulaires mieux localisés 28 jours après la décongélation.

Il a été noté que différents milieux de cryoconservation ont donné des résultats tout aussi efficaces pour atteindre une viabilité cellulaire élevée et une fixation après décongélation.

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