Pour effectuer le placage organoïde, retirez d’abord le surnageant de la centrifugeuse et lavez les cellules du carcinome hépatocellulaire. Remettre les cellules en suspension dans les 50 microlitres d’extrait de membrane basale, ou BME, par puits, pour le placage. Ensuite, suspendez les cellules dans DMEM/F12 avancé.
Ensuite, pipetez doucement les agrégats de cellules jusqu’à ce qu’une suspension uniforme soit visible. Ajoutez du BME à la suspension, en veillant à ce que la concentration de BME se situe entre 30 et 50 %Ensemencez maintenant 50 microlitres de gouttelettes de BME avec des grappes de cellules au centre d’une plaque à 24 puits. Laissez les gouttelettes se solidifier à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Ajoutez 500 microlitres de milieu préchauffé dans chaque puits et incubez dans un incubateur cellulaire à 37 degrés Celsius. Rafraîchir le milieu de culture tous les deux à trois jours. Après deux semaines, remplacez le milieu d’isolement par le milieu d’expansion organoïde.
Après sept à 10 jours de culture, une fois que les organoïdes ont atteint la densité appropriée, traitez les cultures au besoin. Pour faire passer les organoïdes, préchauffez d’abord les plaques de culture cellulaire de surface à très faible fixation dans un incubateur. Ensuite, décongelez le BME congelé pendant la nuit à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit juste avant utilisation.
Préchauffer la solution de récolte d’organoïdes et le substitut de trypsine à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’étape de préparation, retirez le milieu de culture de la plaque de culture des organoïdes. Transférez ensuite la suspension organoïde dans un tube de 15 millilitres.
Ajoutez maintenant la solution de récolte d’organoïdes proportionnellement à la quantité de BME. Pour mélanger la suspension, utilisez un pistolet à pipette de 1000 microlitres pour gratter et pipeter de haut en bas. Après avoir incubé le tube à température ambiante pendant 30 minutes, utilisez une pipette d’un millilitre pour aspirer soigneusement le BME.
Assurez-vous que le BME est complètement dissous. Surveillez l’extrait toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’un amas de cellules organoïdes claires soit visible. Ensuite, centrifugez à température ambiante à 400 g pendant cinq minutes.
Retirez autant de surnageant que possible. Pour commencer la digestion enzymatique des organoïdes du carcinome hépatocellulaire, ajoutez un à cinq millilitres du substitut de trypsine préchauffé à la pastille organoïde cultivée. Incuber la suspension à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.
Utilisez un microscope pour vérifier si les organoïdes se dissocient en petits amas de deux à 10 cellules. Pour arrêter la digestion, ajoutez un volume approprié de milieu basal froid. Ensuite, centrifugez les organoïdes à 400 g pendant cinq minutes à huit degrés Celsius.
Retirez soigneusement le plus de surnageant possible. Remettre en suspension le nombre souhaité d’organoïdes dans la matrice appropriée pour le placage. Tous les 10 jours, les organoïdes passent, en fonction de la densité de croissance des organoïdes.
Des sphéroïdes d’organoïdes HCC ont été observés dans les trois jours suivant la culture. Des sphéroïdes compacts aux bords arrondis et au cytosol perméable ont été observés le premier jour de l’établissement. Les organoïdes étaient de taille similaire et avaient le plus grand diamètre lorsqu’ils étaient cultivés dans 30 à 50 % d’EMB.
Le BME était le plus fragmenté à 10 %, ce qui a donné les organoïdes les plus petits. Le BME était le plus intact à 100 %, mais a donné lieu à des organoïdes de diamètre intermédiaire. L’organoïde HCC proliférant a atteint une taille supérieure à 500 micromètres dans chaque culture après trois générations.
Des organoïdes de CHC de taille substantielle de plus de 1000 micromètres ont été obtenus au cours d’une période de culture de 20 jours.
