Pour commencer, décongelez le flacon cryogénique du PBMC dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes tout en le retournant doucement. Transférez ensuite les cellules décongelées dans un tube conique de 50 millilitres. Rincez le flacon cryogénique avec un millilitre de milieu de culture complet chaud et ajoutez la solution goutte à goutte aux cellules du tube conique pour effectuer la première étape de dilution.
Maintenant, centrifugez la suspension cellulaire pendant cinq minutes et inclinez le tube conique couramment pour éliminer le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans trois millilitres de milieu de culture complet et chaud. Pour le comptage cellulaire, mélangez 10 microlitres de suspension cellulaire avec du bleu de trypan.
Comptez les cellules à l’aide de 10 microlitres de solution cellulaire colorée, soit à l’aide d’un compteur de cellules automatisé, soit d’une chambre cellulaire. Utilisez un milieu de croissance complet chaud pour diluer les cellules afin d’obtenir une concentration finale d’une fois 10 à six cellules par millilitre. Ensuite, semez 100 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire à 96 puits.
Ajouter 100 microlitres de la dilution du médicament deux fois dans chaque puits. Pour récolter les cellules, centrifugez la plaque de culture cellulaire pendant 10 minutes. Utilisez une pompe à vide pour éliminer le surnageant tout en plaçant l’embout de la pompe dans le coin inférieur du puits pour retenir les cellules.
Ajoutez maintenant 200 microlitres de PBS glacé dans chaque puits. Après avoir centrifugé la plaque pendant cinq minutes, retirez le surnageant. Ajoutez ensuite 15 microlitres de tampon de lyse dans chaque puits.
À l’aide d’un film d’étanchéité adhésif, scellez la plaque pour la protéger contre la contamination. Faites tourner la plaque et centrifugez-la pendant une minute. Enfin, prélevez six microlitres de la solution cellulaire lysée dans une plaque PCR.
