Pour commencer, récoltez les PBMC traités par centrifugation et collectez le lysat cellulaire dans une plaque PCR. Centrifugez la plaque pour recueillir le lysat au fond. Ensuite, effectuez la dénaturation de l’ARNm à l’aide d’un thermocycleur.
Ajoutez ensuite six microlitres du mélange réactionnel de transcriptase inverse dans chaque puits pour obtenir un volume total de 12 microlitres. Scellez la plaque pour éviter la contamination et l’évaporation. Centrifugez la plaque après l’avoir brièvement vortexée.
Positionnez la plaque sur le thermocycleur et lancez le programme de réaction de transcription inverse. Après la transcription inverse, centrifugez la plaque PCR, ajoutez 15 microlitres du mélange de pré-amplification dans chaque puits et scellez-le. Placez la plaque scellée sur le thermocycleur et démarrez la réaction de pré-amplification.
Pour nettoyer l’ADNc, ajoutez des billes de purification magnétiques dans chaque puits et incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Placez la plaque PCR sur une grille magnétique pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que les billes se séparent. Après cela, retirez soigneusement le surnageant.
Tout en maintenant la plaque sur la grille magnétique, introduisez délicatement 100 microlitres d’éthanol à 80 % fraîchement préparé pour nettoyer les billes. Après une incubation de 30 secondes, utilisez une pipette pour éliminer le surnageant. Laissez les billes sécher à l’air libre sur la grille magnétique pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que l’éthanol s’évapore complètement et que les billes ne semblent plus brillantes.
Après avoir retiré la plaque de la grille magnétique, suspendez à nouveau les billes dans 20 microlitres d’eau sans nucléase. Repositionnez la plaque sur la grille magnétique jusqu’à ce que les perles soient séparées. Transférez l’eluit sur une plaque PCR fraîche préparée pour le contrôle de la qualité et le marquage de l’ADNc.
Pour le marquage, ajoutez trois microlitres du mélange de marquage pour chaque réaction sur une nouvelle plaque PCR. Ajoutez un microlitre d’ADNc à chaque réaction. Démarrez immédiatement la réaction de marquage.
Neutralisez ensuite la réaction en ajoutant un microlitre de tampon de marquage neutralisé à chaque réaction. Pour la PCR d’enrichissement, ajoutez neuf microlitres du mélange de PCR d’enrichissement dans chaque réaction pour obtenir un volume total de 14 microlitres. Lancez le programme d’enrichissement par PCR.
