Commencez la procédure en créant des mottes d’immobilisation en agarose. Pour ce faire, chauffer et mélanger 2% d’agarose dans du PBS, à l’aide d’un micro-ondes, jusqu’à ce que la solution soit liquéfiée. Pipeter 250 microlitres d’agarose liquéfiée dans une boîte à fond en verre.
Et, à l’aide d’une lamelle en plastique souple, aplatissez l’agarose sur le plat. Une fois que l’agarose refroidit et se solidifie complètement, utilisez une pince à pointe fine pour retirer la lamelle. Ensuite, à l’aide d’un poinçon de biopsie de trois millimètres, créez un trou dans l’agarose au centre de la boîte.
À l’aide d’une lingette délicate, retirez l’excès d’agarose. Conservez le moule à agarose, hydraté avec du PBS, à quatre degrés Celsius, jusqu’à utilisation. Avant de monter la lentille oculaire miroir isolée, ajoutez deux millilitres du milieu approprié dans le moule en agarose préparé, selon le type de lentille.
À l’aide d’une pince à embryons, transférez délicatement la lentille fixe ou vivante dans le divot de l’agarose. Ensuite, placez la boîte sur une platine de microscope inversée. Confirmez que le cristallin est situé avec la région antérieure face à l’objectif, en visualisant la coloration des noyaux.
Si aucun noyau n’est observé, utilisez une pince incurvée pour faire pivoter doucement la lentille d’environ 180 degrés, de sorte que la région antérieure fasse face à l’objectif. Ensuite, procédez à l’acquisition d’images à l’aide d’un microscope confocal. Pour la visualisation des capsules de lentilles, acquérez des images Z-stack à l’aide d’un objectif 40x, avec une taille de pas de 0,3 micron.
Acquérir la première image avant la surface de la capsule du cristallin, indiquée par la coloration WGA, et la dernière image après la surface apicale des cellules épithéliales. Pour visualiser les cellules épithéliales, acquérez des images Z-stack à l’aide d’un objectif 63x avec une taille de pas de 0,3 micron.
