Pour commencer, sélectionnez une plaque à 24 puits contenant des inserts avec des filtres de 0,4 micron. À l’aide d’une pipette, ajoutez 500 microlitres d’HBSS en dessous et au-dessus des inserts filtrants. Fermez ensuite la plaque multi-puits et placez-la dans un incubateur pendant deux heures.
Après l’incubation, aspirez soigneusement le HBSS de la plaque. Préparez une solution de collagène acellulaire dans un tube stérile de 50 millilitres dans du DMEM sur glace. Ajoutez 250 microlitres de collagène au-dessus du filtre à membrane et placez le couvercle sur l’assiette.
Laisser la solution polymériser à température ambiante. Ensuite, retirez la culture de cellules de fibroblastes L-929 de l’incubateur. Ajoutez deux millilitres d’une solution d’EDTA de trypsine préchauffée dans le flacon et placez-le dans un incubateur pendant trois à cinq minutes.
Transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de 15 millilitres et centrifugez à 645 G pendant cinq minutes. À l’aide d’une pompe à vide, aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un millilitre de DMEM. Ajouter 20 microlitres de suspension cellulaire dans un tube contenant 20 microlitres de solution de Trypan Blue.
Et utilisez une chambre de comptage cellulaire pour évaluer la densité cellulaire. Ensuite, retirez la culture de cellules monocytaires U-937 de l’incubateur. Centrifugez la suspension cellulaire et remettez en suspension la pastille dans un millilitre de RPMI.
Après vous être assuré que les cellules sont en suspension de manière homogène, comptez-les à l’aide d’une chambre de comptage de cellules. Ensuite, préparez des suspensions cellulaires contenant respectivement 50 000 cellules de L-929 et 15 000 cellules d’U-937 dans 50 microlitres de DMEM. Ajoutez chaque suspension cellulaire de 50 microlitres à 450 microlitres de collagène et mélangez soigneusement.
Superposez la lamina propria acellulaire précodée avec 500 microlitres de la solution cellulaire de collagène. Fermez la plaque et placez-la dans un incubateur pendant deux heures pour permettre à la solution de prendre. Ensuite, retirez la culture cellulaire Caco-2 de l’incubateur.
À l’aide d’une pompe à vide, aspirez le fluide et rincez les cellules avec 10 millilitres de PBS. Ajoutez cinq millilitres de solution d’EDTA de trypsine PBS et placez-la dans un incubateur pendant cinq à huit minutes. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire et remettez en suspension la pastille dans un millilitre de DMEM.
Après le comptage, préparez une suspension cellulaire contenant 150 000 cellules Caco-2 dans 50 microlitres de DMEM. Placez la plaque dans une hotte à flux laminaire pendant 10 minutes avant de la transférer dans l’incubateur. Après 30 minutes, ajoutez 500 microlitres de DMEM au-dessus du modèle reconstruit et 500 microlitres sous le filtre et remettez la plaque dans l’incubateur.
Le lendemain, remplacez soigneusement le milieu par 500 microlitres de DMEM frais au-dessus et au-dessous du filtre respectivement.
