Pour commencer, transférez 20 millilitres de l’échantillon de raisin fermenté dans un tube stérile à bouchon vissé de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 10 millilitres d’eau froide dans le tube et vortex pour homogénéiser. Centrifuger l’échantillon à 800 G pendant une minute à quatre degrés Celsius.
Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres et centrifugez à 3000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans un millilitre de PBS. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à bouchon à vis de deux millilitres et centrifuger à 14 000 G pendant deux minutes.
Maintenant, remettez la pastille en suspension dans 978 microlitres de tampon de phosphate de sodium de pH 7,4 et 122 microlitres de tampon d’ADN. Faites tourbillonner le tube et placez-le à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes à une heure. Transférez un millilitre de l’échantillon dans une solution de lyse, un tube et serrez le bouchon.
Homogénéiser l’échantillon trois fois dans un broyeur à billes pendant 60 secondes chacune. Ensuite, centrifugez le tube E de la matrice de lyse pendant une minute à 16 800 G.Transférez le surnumérant dans un microtube propre et ajoutez 250 microlitres de solution de précipitation de protéines dans le tube. Secouez le tube 10 fois pour mélanger le contenu.
Centrifuger l’échantillon pendant cinq minutes à 16,800 G et transférer le surnageant dans un tube stérile de 15 millilitres. Ajoutez ensuite un millilitre de suspension de matrice de liaison au surnageant et mélangez en inversant les tubes pendant deux minutes avant de les placer dans un rack pendant trois minutes. Après avoir retiré un millilitre de surnageant, remettre la matrice en suspension dans le surnageant restant.
Transférez 600 microlitres du mélange dans un tube filtrant et centrifugez. Ensuite, décantez le flux et ajoutez 500 microlitres de solution de lavage dans le tube filtrant d’essorage. Retirez le filtre d’essorage et placez-le dans un tube de récupération frais pendant cinq minutes.
Après séchage, ajoutez 50 microlitres d’eau tiède sans DNAse sur la membrane filtrante et remuez doucement la matrice avec une pointe de pipette. Centrifuger à 14 500 G pendant une minute pour éluer l’ADN. Chargez l’échantillon sur un gel d’agarose.
Enfin, mesurez la concentration d’ADN.
