Pour commencer, utilisez des amorces spécifiques 515f et 806r pour amplifier la région hypervariable V4 du gène 16S rNA. Effectuez une PCR en utilisant les conditions données. Ensuite, ajoutez 3,5 microlitres de tampon de séquençage et 1,5 microlitre de mélange d’enzymes dans le tube.
Après avoir mélangé et essoré l’échantillon, mettez en place une réaction de thermocycleur. Maintenant, ajoutez le mélange de ligature de l’adaptateur dans le tube et incubez à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un thermocycleur. Ajoutez 1,5 microlitre d’enzyme réactive d’extension spécifique à l’uracile au mélange de ligature et incubez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Maintenant, ajoutez 43,5 microlitres de billes magnétiques à l’ADN de ligature de l’adaptateur et mélangez 20 fois. Après cinq minutes, placez le tube dans une grille magnétique pendant cinq à 10 minutes pour séparer les billes et jetez le surnageant. Lavez le granulé avec 100 microlitres d’éthanol à 80% et séchez les billes pendant 30 secondes.
Pour éluer les billes en granulés, ajoutez 8,5 microlitres de 10 millimolaires de Tris HCl dans le tube et incubez pendant deux minutes. Placez le tube dans un support magnétique et retirez 7,5 microlitres d’ADN éludé en tant que surnageant dans un nouveau tube. Ajoutez des réactifs PCR dans le tube contenant de l’ADN ligaturé de l’adaptateur pour mettre en place une réaction de 25 microlitres.
Pour nettoyer l’ADN amplifié, ajoutez 22,5 microlitres de billes magnétiques dans le tube et mélangez 20 fois. Après cinq minutes, retirez 50 microlitres de surnageant et lavez les billes avec 100 microlitres d’éthanol à 80%. Remettre en suspension les perles brun foncé dans 16 microlitres d’eau et mélanger 20 fois.
Placez le tube dans le rack magnétique pendant 30 à 60 secondes et transférez 15 microlitres dans un nouveau tube. Mélangez 90 microlitres de tampon, un microlitre de colorant et deux microlitres d’échantillon de banque d’ADN et lisez la concentration d’ADN sur un fluorimètre. Après avoir dilué l’ADN en deux nanomolaires, chargez 27 à 30 microlitres de la cellule d’écoulement et placez-la dans le séquenceur.
Enregistrez les fichiers FASTQ obtenus à partir du séquenceur. Cliquez pour ouvrir un fichier de feuille de calcul et créer un fichier de mappage ou de métadonnées. Ouvrez le site Web de Nephele, téléchargez les fichiers FASTQ et lisez QC End QIIME2, Perform Filtering and Trimming.
Ensuite, à l’aide de DADA2, exécutez des lectures d’extrémités appariées démultiplexées, la substitution de filtres, les erreurs de chimère et la fusion. Utilisez le classificateur naïf bayésien entraîné sur l’unité taxonomique opérationnelle à 99 % de Silva version 132, ou base de données OTU, pour effectuer l’affectation taxonomique bactérienne à 97 % de similarité. Ouvrez le site Web MicrobiomeDB.
Cliquez pour télécharger les fichiers et générer des courbes de diversité alpha, bêta, d’abondance relative et de raréfaction OTU. Enfin, ouvrez une feuille de calcul et transférez des données pour créer des cartes thermiques, des diagrammes de Venn et une taille d’effet d’analyse discriminante linéaire. Une carte thermique basée sur l’abondance relative des bactéries à différents stades de la vinification a montré la dominance de phylums tels que Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota et Fusobacteriota.
Au niveau du genre, des genres importants comme les Enterobacteriaceae et les Lactobacillaceae ont été identifiés. Une analyse du diagramme de Venn a révélé 15 UTO uniques partagées, du moût de raisin au vin final. Les résultats du séquençage des amplicons basé sur la région variable V4 ont également indiqué que la diversité alpha dans les deux traminettes R et L.L’analyse de la diversité bêta a montré un changement dans les bactéries pendant la fermentation, mais la composition bactérienne du vin final était similaire à celle des étapes du moût et de la levure ajoutée.
