Pour commencer, dissolvez deux milligrammes de PEG multivalent avec un groupe réactif maléimide et un millilitre de tampon phosphate 100 millimolaires. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 micromètre. Ajoutez les conjugués peptidiques d’ADN terminés par la cystéine à la solution.
Utilisez la chromatographie d’exclusion stérique pour éliminer les matériaux non conjugués. Exécutez les échantillons dans PBS. Surveillez l’absorbance du pour détecter l’ADN et les peptides.
Placer l’échantillon dans les tubes filtrants centrifuges et concentrer les nanocapteurs synthétisés par centrifugation selon la vitesse recommandée par le fabricant. Utilisez une plaque de 96 puits comme base pour une chambre de logement personnalisée. Pour recueillir l’urine pour les mesures de base, placez d’abord une souris dans la chambre du boîtier.
Appliquez une légère pression sur la vessie de la souris immobilisée pour expulser toute urine restante sur la plaque. Pipeter l’urine recueillie dans un tube de 1,5 millilitre. Préparez 200 microlitres de solution d’injection de nanocapteurs dans du PBS stérile.
Injectez par voie intraveineuse 200 microlitres de la solution dans chaque souris. Après une heure d’injection, prélevez les échantillons d’urine des souris témoins et expérimentales. Pour la détection CRISPR des codes-barres ADN par fluorescence, centrifuger les échantillons d’urine à 800 G pendant cinq minutes à température ambiante.
Combinez maintenant les réactifs CRISPR, puis ajoutez l’enzyme Cas12a avant de pipeter doucement le mélange réactionnel de haut en bas. Incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Exécutez ensuite la réaction du rapporteur en utilisant le mélange d’ADN rapporteur basé sur FRET.
Ajoutez le mélange dans une plaque de 384 puits et mesurez immédiatement la fluorescence à 37 degrés Celsius toutes les deux minutes pendant trois heures pour surveiller la cinétique de clivage. Pour effectuer une détection CRISPR sur papier, exécutez une réaction de rapporteur alternative après l’incubation de la réaction CRISPR à l’aide d’un rapporteur d’ADN marqué à la biotine FAM. Après avoir combiné les réactifs dans une plaque de 96 puits, couvrez-la de papier d’aluminium, puis placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ajoutez maintenant 80 microlitres de PBS dans un puits frais d’une plaque de 96 puits. Pipeter 20 microlitres de mélange de réaction rapporteur dans ce puits. Placez une bande de papier à flux latéral dans chaque puits et attendez que le liquide atteigne le haut de la bande.
L’ADN simple brin chimiquement modifié a démontré une activation de Cas12a par rapport à l’ADN double brin non modifié et à l’ADN simple brin. Les molécules d’ADN modifiées dans l’urine non traitée ont montré une lecture colorimétrique sur des bandes de papier à flux latéral. La bande d’échantillon principale indiquait la libération de FAM détectable par le clivage rapporteur déclenché par l’ADN urinaire.
