Pour commencer, placez les moules à micropuits PDMS, la solution de rinçage anti-adhérence et les vêtements de laboratoire nécessaires dans une hotte de culture tissulaire. Pour laver les moules à micropuits PDMS, utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour ajouter 300 microlitres de solution de rinçage anti-adhérence dans chaque puits. Ensuite, centrifugez la plaque, 1 620 G pendant trois minutes.
Utilisez une pompe à vide et une pipette Pasteur pour aspirer la solution. Ensuite, placez 500 microlitres de suspension cellulaire à la concentration souhaitée dans les micropuits et centrifugez la plaque à 1 620 G pendant trois minutes. Placez la plaque dans un incubateur humidifié pour permettre la formation de sphéroïdes.
Pour récolter les sphéroïdes, à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, ajoutez fermement 500 microlitres de milieu complet dans chaque puits. Pipeter le milieu ajouté de haut en bas à chaque quadrant trois à quatre fois pour déloger les spéroïdes. Utilisez ensuite la pipette pour aspirer doucement le milieu contenant les sphéroïdes dans un tube de microcentrifugation.
Transférez 50 microlitres de suspension stéroïdienne dans un tube de microcentrifugation. Ensuite, ajoutez-y séquentiellement de l’acrylate PEG à 4 bras et du dithiol PEG. Mélangez la solution résultante en la pipetant de haut en bas environ 10 fois.
Pour obtenir 100 microlitres d’une solution de précurseur d’hydrogel PEG à 10 % en poids en volume, pipeter 20 microlitres de solution de précurseur de gel entre deux lames de verre doublées de parafilm séparées par des entretoises en silicium d’un millimètre et incuber les lames avec une solution de précurseur de gel pour permettre la gélification. Une fois la gélification de l’hydrogel terminée, à l’aide d’une spatule, décollez délicatement les gels des lames de verre séparées. Placez un gel par puits dans une assiette de 24 puits, en veillant à ce que la surface contenant les sphéroïdes soit tournée vers le haut.
Ajoutez 500 microlitres de milieu complet dans chaque puits pour immerger complètement l’hydrogel. Placez la plaque multi-puits dans un incubateur humidifié pour cultiver les cellules. La technique décrite utilisant des moules à micropuits a abouti à la formation de sphéroïdes de formes sphériques et de polydispersité étroitement contrôlée.
Pour les sphéroïdes avec 3 300 cellules par micropuits, la taille moyenne des sphéroïdes était d’environ 250 microns et la circularité était supérieure à 0,8, en considérant une valeur de 1 comme une sphère parfaite. Les diamètres des sphéroïdes dépendaient de la taille du micropuits et du nombre de cellules par micropuits.
