Pour commencer, aspirez le milieu des puits où les cellules encapsulées dans de l’hydrogel sont cultivées dans la plaque à 24 puits. Rincez les hydrogels en pipetant 500 microlitres de PBS directement sur chaque puits contenant les hydrogels, puis aspirez doucement le PBS. À l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, ajouter 500 microlitres de solution fixatrice par puits pour fixer les sphéroïdes dans la plaque de 24 puits.
Laissez le fixateur tremper les gels pendant 30 minutes à température ambiante, avant de pipeter la solution de fixateur et de la jeter dans un conteneur à déchets désigné. Ensuite, rincez les hydrogels avec du PBS trois fois comme démontré précédemment. S’ils ne sont pas utilisés immédiatement, stockez les hydrogels dans 500 microlitres de PBS par puits à quatre degrés Celsius pendant une semaine maximum.
Pour colorer les cellules encapsulées dans de l’hydrogel, préparez d’abord des anticorps primaires dilués de manière appropriée pour la nestine et SOX2. Après avoir aspiré le PBS des puits, ajoutez 50 microlitres d’anticorps dilués dans chaque puits. Incuber les cellules avec les anticorps pendant 24 heures pour les colorer complètement.
Ensuite, à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, retirez la solution de coloration et jetez les déchets de manière appropriée. Après avoir rincé les hydrogels trois fois, conservez-les dans du PBS à quatre degrés Celsius jusqu’à deux semaines avant l’imagerie, ou imagez immédiatement. Pour éliminer le sphéroïde coloré afin d’améliorer la transparence de l’imagerie, aspirez d’abord le PBS de chaque puits.
Ensuite, traitez séquentiellement les sphéroïdes avec 500 microlitres de 20%, 40% et 80% de formamide par puits pendant 90 minutes chacun. Enfin, incubez les hydrogels dans du formamide à 100 % pendant 24 heures avant l’imagerie. Les sphéroïdes ont été imagés à différentes profondeurs de la pile z, ce qui a permis d’évaluer la viabilité cellulaire à chaque emplacement de la pile z.
Une projection maximale utilisant l’empilement de sphéroïdes représentait le point le plus élevé de l’intensité lumineuse à chaque endroit, simplifié en une seule image. Des images représentatives de sphéroïdes colorés ont révélé que le facteur de transcription d’auto-renouvellement, SOX2, était co-localisé avec le DAPI dans le noyau. Au contraire, le marqueur des cellules souches nestin était présent dans toutes les cellules.
Il n’y avait pas de différence entre le sphéroïde flottant librement sans gel et les sphéroïdes encapsulés, peut-être en raison de l’inertie du gel PEG utilisé. Les images représentatives de coupes optiques à environ 90 microns dans des sphéroïdes clairsemés et non clairsemés ont révélé que lorsque le dégagement a été effectué, le noyau du sphéroïde pouvait être imagé environ 30 microns plus profondément par rapport à un sphéroïde non clair.
