Pour commencer, démarrez le logiciel du cytomètre en flux. Ouvrez une nouvelle expérience. Ajoutez le nombre d’échantillons souhaité et nommez-les.
Configurez ensuite un histogramme de canal YL2-H ou RL1-H, un diagramme de points de zone de diffusion directe par rapport à la zone de diffusion latérale, un graphique de points de zone de diffusion directe par rapport à la hauteur de diffusion avant et un diagramme de points de canal BL1-H par rapport à VL2-H. Placer les cellules témoins de Trypanosoma brucei de type sauvage non colorées sur le port d’injection de l’échantillon et ajuster la position de la platine. Pour réduire la taille du fichier, décochez les canaux qui ne sont pas destinés à être enregistrés.
Commencez à un faible débit pour permettre des ajustements. Cliquez ensuite sur Exécuter pour commencer l’acquisition des données. Ajustez la tension YL2 ou RL1 pour aligner le pic principal entre 10 et 10 à 10 ou quatrième unités d’intensité de fluorescence relative.
Ajustez les tensions de diffusion directe et latérale pour vous assurer que plus de 90 % des événements se situent dans la plage du diagramme de points. Définissez le seuil de diffusion vers l’avant pour exclure les débris sans omettre les cellules viables. Modifier les paramètres des canaux VL 2 et BL 1 pour positionner le pic primaire du témoin de type sauvage non coloré entre 10 et 10 à la quatrième unité d’intensité de fluorescence relative.
Cliquez sur Enregistrer et mesurer au moins 10 000 événements. Placez ensuite le premier échantillon de Trypanosoma exprimant la pHluorine induite et coloré à l’iodure de propidium ou au rouge de thiazole sur l’orifice d’injection de l’échantillon. Encore une fois, commencez l’acquisition des données à faible débit après avoir effectué le rinçage.
Surveillez chaque tracé pour vous assurer que plus de 90 % des événements sont correctement capturés et que les canaux VL2-H et BL1-H ne sont pas saturés. Enregistrez les données de chaque échantillon au format de fichier FCS et préparez-les pour l’analyse.
