Pour commencer, effectuez une cytométrie en flux sur des cellules de Trypanosoma brucei exprimant le fluor. Ouvrez une nouvelle mise en page, puis faites glisser et déposez les fichiers FCS acquis dans la fenêtre de mise en page. Pour bloquer les cellules vivantes, sélectionnez le contrôle de type sauvage non coloré pour ouvrir une fenêtre.
Analysez les données à l’aide d’histogrammes sur le canal YL2H ou RL2H. Dans ce cas, utilisez un histogramme YL2H car les échantillons ont été colorés à l’iodure de propidium. Ensuite, établissez une porte bissectrice pour séparer les cellules vivantes et mortes, en étiquetant la porte gauche comme vivante et la porte droite comme morte.
Appliquez et ajustez cette porte sur tous les échantillons. Assurez-vous que la porte est correctement dessinée en visualisant la porte sur plusieurs échantillons du jeu de données. Sur le contrôle de type sauvage non taché, double-cliquez sur la porte en direct.
Définissez l’axe X du diagramme à points sur la zone de diffusion vers l’avant et l’axe Y sur la zone de diffusion latérale. Utilisez ensuite l’outil Porte polygonale pour délimiter la population de cellules, en l’étiquetant cellules. Excluez les débris ou les cellules et agrégats mourants en faisant attention à leur position typique dans le diagramme à points.
Appliquez la porte des cellules sous la porte vivante pour tous les échantillons, en veillant à ce qu’elle couvre la population cellulaire probable pour tous les échantillons. Double-cliquez sur la porte des cellules sur le contrôle de type wild non coloré pour afficher les événements à l’intérieur de cette porte. Pour ajuster le diagramme à points, définissez l’axe X sur la zone de diffusion vers l’avant et l’axe Y sur la hauteur de la diffusion vers l’avant.
Identifiez la distribution diagonale des cellules simples sur ce diagramme à points, en les distinguant des doublets. Utilisez l’outil Porte polygonale pour encercler les événements singulet, en nommant ce singulet de porte. Appliquez la porte des singlets sous la porte des cellules pour tous les échantillons, en veillant à exclure les doublets tout en incluant les singulets, et ajustez la porte si nécessaire pour les différents échantillons.
Sur l’échantillon de contrôle de type sauvage non coloré, double-cliquez sur la porte des singlets. Modifiez l’axe X du diagramme à points en BL1H et l’axe Y en VL2H. À l’aide de l’outil Porte polygonale, dessinez une porte diagonale pour capturer les cellules fluorescentes au fluor-2 dans VL2 et BL1.
Étiquetez cette porte comme pHL positive. Appliquez la porte positive pHL sous la porte des singlets pour tous les échantillons. Ajustez la porte pHL pour couvrir les cellules ayant une intensité de fluorescence plus élevée que les cellules autofluorescentes du témoin de type sauvage.
Pour exporter les statistiques, cliquez sur l’éditeur de tableau, puis sur la barre d’édition, et enfin, sélectionnez ajouter une colonne. Incorporer des colonnes pour le nombre total non traité, le nombre de pHL positif, la fréquence vivante du total, la fréquence pHl positive du parent, la médiane pHL positive VL2H et la médiane pHL positive BL1H. Pour ajuster les paramètres d’exportation dans l’éditeur de table, définissez l’affichage sur le fichier et le texte sur CSV.
Sélectionnez la destination et le nom du fichier, puis cliquez sur Créer une table. Une légère acidification progressive a été observée au fil du temps en réponse à la famine, qui s’est stabilisée de 90 minutes. Après avoir réintroduit le glucose comme indiqué par la ligne verte, le pH glycosomal est revenu aux niveaux d’avant la famine en 30 minutes, ce qui suggère que le pH glycosomal est dynamique et régulable en réponse au glucose.
