Pour commencer, préparez la solution tampon externe GUV dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Mélange de spermidine, d’ATP, de GTP, de CTP, d’UTP, de phosphate de créatine, d’acétate de magnésium, de glutamate de potassium, d’HEPES, d’hydroxyde de potassium, d’acide folinique. glucose et stock d’acides aminés.
Ajoutez de l’eau désionisée ultra purifiée pour porter le volume final de la solution à un millilitre. Ensuite, dans une hotte, ajoutez 17,3 microlitres de solution mère de POPC dans un flacon en verre de 15 millilitres. Pour cela, pipette 1,08 microlitres de copolymère PEO-b-PBD.
Soufflez doucement un léger jet d’argon dans le flacon en verre tout en tournant le flacon pour évaporer le chloroforme. Ensuite, pipetez 1,2 millilitre d’huile minérale légère dans le flacon en verre. Tourbillonnez le lipide et l’huile à vitesse maximale pendant 10 à 20 secondes.
Placez le flacon en verre dans un four à environ 50 degrés Celsius pendant 20 minutes avant de tourbillonner pendant 10 à 20 secondes supplémentaires à vitesse maximale. Ensuite, pipetez 270 microlitres de la solution extérieure GUV dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Pour cela, pipetez 15 microlitres chacun de cinq molaires de chlorure de sodium et 4,5 molaires de chlorure de potassium.
Pipetez doucement 300 microlitres de mélange de lipides et d’huile sur la solution extérieure GUV. Après l’incubation, assembler une réaction CFE en pipetant les solutions 1 à 3, le plasmide d’ADN codant pour la sfGFP soluble ou des variantes du récepteur du glutamate sfGFP, de l’ARNnase murine et d’une molaire de saccharose dans un flacon. Ajoutez de l’eau déminéralisée ultrapure pour porter le volume de réaction à 20 microlitres.
Ajoutez 600 microlitres du mélange lipide-huile dans le tube de microcentrifugation contenant le mélange réactionnel de 20 microlitres. Pipetez vigoureusement de haut en bas pendant une minute pour émulsionner la réaction. Superposez doucement l’émulsion interne sur la couche d’huile dans le tube.
Centrifuger pendant 10 minutes à 2000 g à quatre degrés Celsius. Ensuite, pipetez soigneusement l’excès d’huile et la solution extérieure du tube de microcentrifugation. Mélangez délicatement la pastille GUV dans la solution restante pour la remettre en suspension.
Transférez la solution GUV dans une plaque à fond plat claire et propre à 96 puits pour l’incubation. Transférez la plaque scellée dans un lecteur de plaque pour l’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq à six heures. Après l’incubation, placez la plaque sur un microscope confocal inversé.
Concentrez-vous sur une région d’intérêt contenant les GUVs, puis capturez les images à une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres. Enregistrez les images au format TIFF. Ouvrez les images dans un logiciel de traitement d’images.
Cliquez sur le panneau de réglage Luminosité/Contraste pour l’ouvrir. Ajustez ensuite la luminosité et le contraste pour rendre les protéines fluorescentes visibles. Les réactions d’expression cellulaire du récepteur du glutamate de type sauvage encapsulées dans GUV ont démontré une excellente expression et une excellente localisation membranaire.
Le récepteur PRSP-glutamate était sujet à l’agrégation et à la formation de ponctuations. La sfGFP soluble a été exprimée dans le GUVS et est restée dans le lumen GUV.
