Pour commencer, ajoutez 150 microlitres de tampon de marquage dans les tubes d’échantillonnage contenant les échantillons de myoblastes de souris marqués. Pipetez l’EDTA, le SDS et la protéinase K dans chaque tube. Manipulez le contenu des tubes pour bien mélanger, puis incubez les tubes à 55 degrés Celsius pendant deux heures dans une machine PCR.
Ensuite, pipetez chaque échantillon dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre contenant 200 microlitres de mélange phénol-chloroforme. Vortex le contenu des tubes pour les mélanger. Une fois la centrifugation terminée, transférez la couche supérieure dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Ajoutez ensuite 200 microlitres de chloroforme dans les nouveaux tubes avant de vortex et de centrifuger à nouveau. Aspirez la couche supérieure dans un nouveau tube. Ajoutez maintenant 550 microlitres d’éthanol à 100 % dans chaque tube d’échantillon et mélangez bien en inversant.
Placez ensuite les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant une heure pour induire une précipitation de l’ADN. Centrifuger la solution à vitesse maximale pendant 15 minutes pour obtenir une pastille d’ADN. Après avoir versé le surnageant, lavez la pastille avec de l’éthanol à 75 % avant de la centrifuger à nouveau pendant cinq minutes.
Remettez ensuite le granulé en suspension dans 21 microlitres d’eau distillée doublement. Configurez la PCR à utiliser pour la préparation de la bibliothèque. Utilisez une amorce N7XX Illumina différente pour chaque échantillon et une amorce N5XX universelle.
Entrez le numéro de cycle de PCR dans l’instrument pour exécuter la PCR. Après amplification, électrophorèse trois microlitres des banques sur des gels d’agarose. Les bibliothèques CUT&Tag contenaient principalement des mononucléosomes marqués d’environ 300 paires de bases.
La qPCR a montré que la marque H3K4me1 était fortement enrichie au niveau des régions activatrices du gène MYOD1.
