Pour commencer, prenez une diapositive et ajoutez-y deux fines bandes de ruban adhésif double face pour préparer l’imagerie. Pipetez environ 10 à 15 microlitres de support de montage entre les deux bandes de ruban pour le montage du cerveau. transférer les cerveaux de drosophile marqués sur une lame de microscope avec une pointe de pipette P20 pré-rincée avec du PBS et du Triton X-100 à 0,2 %.
Une fois les cerveaux transférés, utilisez un pinceau fin pour les aligner, en veillant à ce que les lobes antennaires soient tournés vers le haut. Après avoir orienté les cerveaux, couvrez-les d’une lamelle en verre. Ensuite, remplissez les côtés de la lamelle avec un support de montage supplémentaire.
Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent. Après avoir soigneusement séché la lame, conservez-la au réfrigérateur pour une imagerie ultérieure. Utilisez un microscope confocal à balayage laser équipé d’un objectif d’immersion dans l’huile 63X pour l’imagerie.
Utilisez un laser à l’argon 488 et à l’hélium néon 543 pour imager les glomérules synaptiques d’un lobe antennaire et les neurones sensoriels olfactifs Or42a. Déterminez le gain et le décalage optiques pour les deux canaux. Positionnez l’imagerie au centre du cerveau et concentrez-vous sur les glomérules VM7.
Localisez approximativement le trou au milieu du cerveau. Sélectionnez la résolution d’image de 1024 par 1024. Capturez une projection complète de l’empilement confocal Z à travers le lobe antennaire pour garantir la capture de l’innervation complète des neurones Or42a des glomérules VM7.
Chargez le génotype ou l’image aveugle dans Fidji. Pour diviser les canaux de ligne laser, accédez à l’image, cliquez sur couleur et sélectionnez Diviser les canaux. Dans le canal sensoriel olfactif Or42a, faites défiler la pile Z pour déterminer quelles tranches contiennent l’innervation neuronale Or42a, en identifiant le début et la fin de la fluorescence.
Pour créer une projection de tranches de somme qui inclut uniquement les tranches avec innervation de neurone Or42a, cliquez sur image et accédez à piles. Cliquez ensuite sur le projet Z, sélectionnez Somme des tranches et entrez la plage souhaitée. Utilisez l’outil lasso aux Fidji pour tracer le contour de l’innervation du neurone Or42a dans le glomérule VM7.
Multipliez la circonférence de l’aire tracée par le nombre de tranches de pile Z et l’épaisseur de chaque tranche pour calculer le volume d’innervation du glomérule synaptique VM7. Après une exposition de 24 heures à un véhicule odorisant témoin, l’innervation dense Or42a MCD :GFP persiste dans les glomérules VM7 des deux lobes antennaires. En revanche, une exposition de 24 heures à un odorant à 25 % d’EB provoque une taille importante et une perte de volume glomérulaire synaptique.
L’augmentation de la concentration d’odorant EB entraîne une taille synaptique des glomérules de plus en plus importante. Des quantifications représentatives pour cette gamme de concentrations d’odorant EB ont montré des résultats similaires pour l’intensité de fluorescence et le volume d’innervation.
