Pour commencer, prenez une culture confluente de 70 à 90% de fibroblastes utérins humains. Aspirer le milieu des flacons. Lavez les cellules avec cinq millilitres de DPBS chaud sans calcium ni magnésium.
Après avoir aspiré le DPBS, pipeter quatre millilitres de trypsine EDTA chaude dans chaque flacon. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes jusqu’à ce qu’elles se détachent. Ensuite, ajoutez six millilitres de gouttes et de solution neutralisante dans chaque flacon.
Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres. À l’aide d’une pipette, bien mélanger la suspension et prélever une aliquote de 10 microlitres pour le comptage des cellules. Mélangez 10 microlitres de suspension cellulaire avec 10 microlitres de Trypan Blue.
Transférez la suspension de cellules colorées dans un hémocytomètre pour le comptage des cellules. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir aspiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans un milieu chaud à fibroblastes.
Lavez maintenant le canal basal d’une puce d’organe microfluidique avec 200 microlitres de milieu fibroblastique. Lavez ensuite le canal apical avec 200 microlitres de milieu épithélial vaginal réchauffé. Ajoutez 200 microlitres de milieu épithélial vaginal complet à l’entrée du canal apical, tout en bouchant la sortie avec un embout de pipette.
Distribuez le fluide jusqu’à ce que les volumes des pointes d’entrée et de sortie soient égaux. Relâchez ensuite la pointe de la pipette de la pipette, en laissant la pointe dans l’entrée. Pipetez lentement 50 microlitres de suspension de cellules de fibroblastes utérins humains dans l’entrée du canal basal, tout en aspirant simultanément par la sortie.
Retirez l’embout de la pipette de l’entrée lorsqu’il reste environ deux microlitres de suspension cellulaire dans l’embout de la pipette. Retournez les puces de prise sur un support de tube de 15 millilitres. Vérifiez que les puces après l’incubation ne sont pas fixées.
Ensuite, bouchez la sortie du canal basal avec une pointe de pipette. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu fibroblastique à l’entrée du canal basal sans appuyer sur le piston de la pipette. Relâchez la pointe de la pipette pour permettre au fluide de s’écouler librement à travers le canal jusqu’à la pointe de sortie de la pipette par écoulement gravitationnel.
Incuber les copeaux ensemencés de fibroblastes pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une supplémentation en dioxyde de carbone de 5 %.
