Pour commencer, retirez les billes magnétiques de purification de l’ADN du réfrigérateur à deux à huit degrés Celsius. Centrifugez les billes pendant 10 secondes à 2 500 G après mélange. Transférez le produit de réaction ligaturé de l’adaptateur dans un microtube à centrifuger à faible absorption de 1,5 millilitre.
Ajoutez 45 microlitres de billes magnétiques purifiées d’ADN dans chaque tube. Après avoir tourbillonné les composants, centrifugez le tube pendant 10 secondes, puis placez le tube sur une grille magnétique pendant trois minutes. Jetez soigneusement le surnageant sans pipeter les billes.
Transférez maintenant 300 microlitres d’éthanol fraîchement préparé à 75 % dans chaque micro tube de centrifugation. Faites pivoter doucement les tubes quatre fois à 180 degrés. Une fois que la solution est claire, jetez rapidement le surnageant tout en évitant de pipeter les billes.
Ensuite, centrifugez brièvement les tubes après les avoir retirés du support magnétique. Placez les tubes sur le support magnétique et pipetez le liquide restant. Ouvrez les bouchons des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre et laissez les billes sécher à température ambiante pendant cinq minutes.
Après la décongélation et le vortex des réactifs liés à la PCR, centrifugez les réactifs pendant 10 secondes. Retirez le microtube à centrifuger de 1,5 millilitre du support magnétique et ajoutez des réactifs PCR. Centrifugez brièvement le tube vortex pour éviter les gouttes de liquide sur la paroi et le couvercle du tube.
Transférez ensuite le produit PCR dans un nouveau tube PCR. Incuber sur un thermocycleur et exécuter le programme d’amplification pour des échantillons d’ADN et d’ADNC. Après l’incubation, centrifugez le tube PCR pendant 10 secondes et transférez le produit dans un nouveau microtube à centrifuger à faible absorption de 1,5 millilitre.
Ajoutez 25 microlitres de billes magnétiques purifiées d’ADN dans chaque tube et mélangez bien par vortex. Centrifugez le tube à basse vitesse et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Placez ensuite les tubes sur une grille magnétique pendant trois minutes jusqu’à ce que la solution s’éclaircisse.
Transférez le surnageant dans de nouveaux microtubes à centrifuger, en évitant de pipeter les billes. Transférez 300 microlitres d’éthanol fraîchement préparé à 75 % dans les tubes et lavez les billes deux fois à l’aide d’un support magnétique, comme démontré précédemment. Après avoir brièvement centrifugé les tubes, placez les tubes sur le rack et pipetez le liquide restant.
Ouvrez les bouchons des tubes de 1,5 millilitre et séchez les billes à température ambiante pendant cinq minutes. Pipette 50 microlitres d’éluant dans les tubes. Effectuez une brève centrifugation après avoir tourbillonné les tubes.
Placez les tubes sur une grille magnétique pendant trois minutes jusqu’à ce que la solution devienne claire. Transférez soigneusement le liquide dans un nouveau tube et étiquetez-le avec le nom de la bibliothèque.
