Pour commencer, ensemencez HEK293T cellules dans une usine cellulaire à 10 couches contenant un milieu DMEM à haute teneur en glucose avec 10 % FBS. Placez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius sous une supplémentation en dioxyde de carbone de 5 % pendant la nuit. Ensuite, aliquote 350 millilitres d’Opti-MEM dans une bouteille stérile de 500 millilitres.
Ajoutez l’ADN plasmatique pour la transfection dans le flacon et secouez pour bien mélanger. Ajoutez maintenant 15 millilitres de solution PEI dans le flacon. Agitez vigoureusement le mélange pendant 30 secondes pour assurer un mélange uniforme.
Après avoir incubé le mélange à température ambiante pendant 15 minutes, transférez-le dans une bouteille d’un litre. Ajoutez ensuite 700 millilitres de DMEM à faible teneur en glucose. Retirez la Cell Factory à 10 couches de l’incubateur et aspirez le média dans un conteneur à déchets.
Pipetez soigneusement le mélange de transfects d’ADN dans la Cell Factory. Replacez ensuite la Cell Factory dans l’incubateur pendant 72 à 96 heures. Après trois à quatre jours, filtrez le surnageant clarifié à travers une unité de filtration de 0,45 micromètre.
Ajoutez 500 millilitres de DPBS dans la Cell Factory pour le rincer. Centrifugez-le à 4 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. À l’aide d’un système de vide et d’une pipette aspirante, retirez et jetez le surnageant.
Ajoutez 20 millilitres de tampon de lyse AAV à la pastille et mélangez pour remettre la pastille en suspension dans le tampon. Conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la purification. Ajoutez maintenant une solution de chlorure de sodium à 40 % de PEG à la solution AAV, ce qui porte la concentration finale à 8 % de PEG.
Placez le mélange sur un rotateur orbital à basse vitesse pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Centrifuger la solution à 4 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour précipiter le virus. Pipetez le surnageant.
Ensuite, j’ai eu cinq à 10 millilitres de tampon de remise en suspension AAV HEPES sur le granulé. Transférez la suspension dans un tube conique de 50 millilitres pour poursuivre la purification en aval. Ensuite, fixez une aiguille de calibre 16 montée sur une seringue de 10 millilitres et superposez les gradients d’iodixanol préparés dans un tube d’ultracentrifugeuse en polypropylène à dessus rond.
À l’aide d’une aiguille de calibre 22, ajoutez soigneusement jusqu’à 17 millilitres de solution AAV sur le dessus du gradient. Complétez le tube avec un tampon de dialyse AAV. Scellez les tubes avec une soudeuse électrique.
Centrifugez les tubes à 350 000 g pendant deux heures dans un rotor en titane à quatre degrés Celsius. Transférez-les ensuite dans un support de tube d’ultracentrifugation. Utilisez maintenant une nouvelle aiguille de calibre 18 pour transférer le virus AAV dans une cassette de dialyse.
Retirez l’air de la cassette après y avoir injecté le virus. Placez une barre d’agitation dans le bécher contenant le tampon de dialyse AAV et transférez-la sur une plaque d’agitation. Placez ensuite la cassette de dialyse dans le tampon à l’aide d’une bouée flottante.
À l’aide d’une seringue de 10 millilitres, transférez le virus de la cassette dans une unité de filtration centrifuge. Centrifuger à 4 000 g pendant 15 à 30 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez l’AAV concentré de l’unité de filtration.
Rincez ensuite le filtre avec 300 microlitres de tampon de dialyse AAV. Enfin, transférez la solution de rinçage dans l’AAV concentré. Le virus AVV isolé s’est avéré avoir une pureté supérieure à 90 %, ce qui le rend adapté à une utilisation in vivo.
