Pour commencer, pipetez des gouttelettes de 10 microlitres de solution peptidique 2X au centre des puits dans une plaque à 24 puits. Après l’incubation, pipeter 10 microlitres de 2X PBS dans chaque puits. Utilisez l’extrémité de la pipette pour mélanger doucement la solution, laissez les gouttelettes de gel se stabiliser pendant au moins 20 minutes, en vous assurant que les gouttelettes sont intactes.
Ensuite, pipetez 2,5 millilitres de 0,0125 % de trypsine EDTA dans un flacon contenant 2 millions de cellules d’adénocarcinome colorectal humain SW1222. Incuber les cellules avec de la trypsine à 37 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes jusqu’à ce qu’elles se détachent du ballon. Ajouter cinq millilitres de milieu complet pour inactiver la trypsine.
Filtrez ensuite la suspension cellulaire à l’aide d’une crépine de 30 micromètres. À l’aide d’une micro-pipette de 10 microlitres, injectez deux microlitres de suspension cellulaire dans chaque gouttelette peptidique. Ensemencez 800 cellules de la lignée cellulaire SW1222 dans chaque puits pendant quatre jours.
Incuber les gouttelettes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de milieu supplémenté dans chaque puits. Pour préparer le contrôle, diluez le stock de la matrice de contrôle de la membrane basale avec un milieu supplémenté.
Chargez la suspension cellulaire dans la solution basale de membrane diluée. Pipette 20 microlitres de matrice de membrane basale diluée dans chaque puits avec les cellules. Incuber les cellules pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.
Une fois que les gouttelettes se sont solidifiées, ajoutez 0,5 millilitre de milieu complet. Imagez les cellules à l’aide d’un microscope à fond clair les jours un, quatre et sept pour évaluer la croissance des organoïdes. Une semaine d’imagerie en fond clair des cellules a montré que les petits amas de cellules s’assemblaient en organoïdes.
Les organoïdes dérivés de SW1222 cultivés dans des hydrogels peptidiques avaient une morphologie ronde avec un aspect léger. Une apparence plus foncée indiquait une densité plus élevée indésirable comme on l’a vu dans les colonies du peptide P le septième jour.
